CN109321429B - 一种自动挑菌仪及微生物筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自动挑菌仪及微生物筛选方法，自动挑菌仪包括移液工作站和浊度计，浊度计安装在移液工作站上，本发明还公开了基于自动挑菌仪的微生物筛选方法，该方法用于单个菌株的获取。本发明的移液工作站结合浊度计，相比于以往的移液工作站结合酶标仪，测量环境对于微生物的生长的影响更低，使本发明能够在厌氧环境和其他尽量减少暴露时间的情况下，也能快速准确的测量确定微生物的生长情况；另外，浊度计可直接读取孔内浊度后生成移液工作站的挑取序列文件，供移液工作站挑取微生物。本发明基于自动挑菌仪提供的用于单个菌株的获取的筛选方法，通过使用自动挑菌仪进行筛选，从复杂样品中将单个菌株分离出来，获得了有明显生长的单个菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一种自动挑菌仪及其微生物筛选方法，尤其涉及一种微生物的高通量培养和筛选的挑菌仪以及使用该挑菌仪筛选微生物的方法。
背景技术
移液工作站是一种可自动进行高通量液体试剂转移、稀释的仪器。其可根据微孔板类型和有意义孔位的设定来自动完成转移、稀释和分配等工作。该设备在微生物的高通量培养和筛选工作中具有重要的价值，通过采用酶标仪等仪器对微孔板每个孔位进行读值，然后根据读取的结果和阈值来确定微生物生长情况，再人工设定需要抽取和转移的孔位，这样就大大增加了工作时间。当培养物必须要在厌氧环境或是其他要尽量减少暴露时间的情况下，酶标仪读取然后进行转移这个过程就可能造成培养物的破坏。
浊度计就能克服这种缺陷，浊度计是测定液体浊度的装置，有散射光式、透射光式和透射散射光式等，统称光学式浊度计。其原理为，当光线照射到液面上，入射光强、透射光强、散射光强相互之间比值和水样浊度之间存在一定的相关关系，通过测定透射光强、散射光强和入射光强或透射光强与散射光强的比值来测定水样的浊度。光学式浊度计有用于实验室的，也有用于现场进行自动连续测定的。
目前市面上的酶标仪或者浊度计体积较大，所读取数据也不能被移液工作站直接使用。基于此，需要设计一种自动挑菌仪，结合移液工作站和浊度计，实现高效的分离工作，同时在厌氧环境或是其他要尽量减少暴露时间也可快速准确高效地筛选微生物。
发明内容
为了解决以上问题，本发明的目的是提供一种自动挑菌仪及其微生物高通量筛选方法，该设备能快速高效的培养和筛选微生物，方便研究者使用。
为了实现以上目的，本发明提供了一种自动挑菌仪，包括：
移液工作站，所述移液工作站包括液体抽吸模块和Y轴托盘，所述液体抽吸模块安装在移液工作站的上壳体内，液体抽吸模块由X轴驱动器带动实现X轴移动，所述Y轴托盘安装在移液工作站底端的载物板上，Y轴托盘由Y轴驱动器带动实现Y轴移动，所述Y轴托盘上设有多个板位区，位于左下角的板位区为中空结构。该移液工作站的液体抽吸模块可以对液体进行抽吸，通过在X轴移动，实现液体的转移和稀释。
浊度计，所述浊度计安装在左下角的板位区外侧，所述浊度计包括由步进电机带动实现Y轴移动的U型臂，Y轴托盘位于所述U型臂的上下壁杆间，所述U型臂的上下壁杆上分别设有发射器和与发射器配合的接收器。工作时，左下角的板位区放置有微孔板，微孔板为透明的结构，U型臂在X轴方向移动，每到达微孔板的一个孔时，发射器发出的光线经微孔板孔内的液体后，被接收器接收，根据接收器接收到的信号，控制系统计算孔内液体的浑浊度，进而得知微孔板每个孔内部微生物生长情况。
控制系统，所述控制系统包括控制器，所述控制器与移液工作站和浊度计的信号连接，控制器为常规的单片机，植入程序控制移液工作站和浊度计的运行；具体的，对于移液工作站，控制液体抽吸模块的液体抽吸，控制X轴驱动器带动液体抽吸模块在X轴方向移动，控制Y轴驱动器带动Y轴托盘在Y轴方向移动；对于浊度计，控制发射器发射光线，根据接收器的接收信息，并计算微孔中液体的浑浊度，控制步进电机带动U型臂在Y轴方向移动读取微孔中液体信息。
进一步的是，所述浊度计还包括构成浊度计骨架的左侧板、右侧板、底板、前连接板和后连接板，所述步进电机和U型臂位于骨架内，所述骨架上侧设有遮光罩，对骨架内的部件遮光处理，使接收器能顺利地接收发射器发出的信号，防止外界光线干扰影响接收器接收发射器发出的光线，进而影响对微孔中液体浑浊度的判断。
进一步的是，所述左侧板和右侧板间设有螺杆和限位杆，所述步进电机通过传动齿轮连接螺杆，所述螺杆穿过U型臂下侧的螺纹孔与U型臂螺纹连接，所述限位杆穿过U型臂下侧的通孔。通过螺杆将回转运动变换为直线运动，运动准确性高，且有很大的降速比，结构简单，制造方便，工作平稳，无噪声，可以传递很大的轴向力；限位杆使U型臂只能沿螺杆的长度方向运动，防止U型臂随着螺杆旋转，使U型臂精准地扫描U型臂间的微孔板；传动齿轮为减速齿轮组合，使步进电机的高速转动经传动齿轮转化变为螺杆的低速转动。
进一步的是，所述后连接板上靠近左侧板端设有初始位传感器，所述底板上设有控制电路板，右侧板上设有连接控制电路板的USB接口。在未开始读取微孔板时，U型臂初始化回到初始位传感器处，在无光照和光照无板下接收器接收发射器的信号，由控制系统换算，定位透色度的零点和满点，用于后面计算光照透射率；控制电路板上安装有浊度计的控制电路，控制电路控制接收器、发射器和步进电机的运行，将接收器采集的光信号经过处理换算成液体的浑浊度，控制电路并与控制系统信号连接，受控制系统控制，控制系统根据返回的液体浑浊度信息，会自动的生产挑取文件；USB接口用于浊度计与外部设备的连接和通讯。
进一步的是，所述发射器采用600-605nm LED及透镜组进行发射光准直或是带有准直透镜的650nm半导体激光器，这是根据经典微生物浓度检测使用OD600和OD660选择的；所述接收器采用CdS光敏电阻，由于整合在移液工作站上的浊度计所处环境杂散光较多，采用光电池作为接收器容易被环境光饱和，故采用CdS光敏电阻，其具有较好的浓度信号线性特征。
进一步的是，所述液体抽吸模块包括多个移液头，所述移液头由抽吸杆带动实现液体的抽吸。液体抽吸模块的原理类似针筒抽吸，由抽吸杆上下运动，使移液头抽吸托盘上的液体，移液头还可以在竖直方向移动，通过移液头抽吸液体，移液头抽吸液体由控制系统控制，使移液工作站可以进行液体试剂的转移和稀释，方便微生物的高通量筛选。
进一步的是，所述载物板上设有废料槽，废料槽为倾斜结构，用完废弃后的液体直接倒在废弃槽内，由废弃槽排出。
本发明提供了一种自动挑菌仪的微生物筛选方法，该方法用于单个菌株的获取，包括以下步骤：
步骤S1，准备原始样品，用自动挑菌仪的移液工作站将原始样品稀释，将稀释后的原始样品加入培养基，得到培养基样品，用自动挑菌仪的移液工作站将培养基样品分装到微孔板的微孔中。这里的原始样品为为复杂样品，原始样品包含了多个菌株，本方法的目的是在复杂样品中获取目标单个菌株。
步骤S2，将微孔板内的培养基样品，在目标菌株生长的温度下恒温培养至目标菌株生长。目标菌株指的是需要获取的单个菌株，目标菌株在该菌株适宜生长的温度下培养一段时间后，目标菌株生长；目标菌株的适宜生长温度和培养天数由本领域的技术人员获知该菌株的名称后，查询该菌株的常规生长环境确定。
步骤S3，将培养完成的培养基样品，用自动挑菌仪上的浊度计，读取微孔板上每个微孔中培养基的浊度值，并生成挑取文件。
步骤S4，自动挑菌仪根据挑取文件中浊度计检测结果，设定移液工作站挑菌最小OD值，移液工作站对大于最小OD值的微孔中的培养基进行挑取，即选择微生物已生长的微孔中的培养基进行挑取，得到单个菌株。
进一步的是，本发明提供的微生物筛选方法步骤S3中，浊度计读取微孔板上每个微孔中培养基的浊度值包括以下步骤：
步骤S31，将微孔板放置于Y轴托盘的左下角位，浊度计的U型臂初始化回到初始位传感器处，并读取无光照和光照无板时的信号，定为透射度的零点和满点，用于计算透射率；
步骤S32，Y轴托盘向浊度计方向移动，当移动到微孔板的第一排孔处于U型臂下部的光源正上方后停止移动，然后U型臂按照设定的程序由初始位置向远端逐步移动，每到达一个孔下方后控制器读取该孔的透射率，并换算成光密度值；
步骤S33，重复步骤S31-S32完成对整个微孔板的读取，并由控制器生成挑取文件，控制器即为单片机。
本发明的有益效果：
本发明的移液工作站结合浊度计，相比于以往的移液工作站结合酶标仪，测量环境对于微生物的生长的影响更低，使本发明能够在厌氧环境和其他尽量减少暴露时间的情况下，也能快速准确的测量确定微生物的生长情况；另外，浊度计可直接读取孔内浊度后生成移液工作站的挑取序列文件，供移液工作站挑取微生物；
本发明提供的移液工作站，可以对液体试剂进行转移和稀释，液体抽吸模块对液体进行抽吸，X轴驱动器带动液体抽吸模块在X轴方向移动，Y轴驱动器带动Y轴托盘在Y轴方向移动，液体抽吸模块的移液头还可以在竖直方向移动，实现了三轴联动，对Y轴托盘上放置的微孔板进行液体的转移和稀释，方便微生物的培养和筛选；
本发明提供的浊度计，安装在移液工作站左下角的板位区外侧，Y轴托盘位于浊度计U型臂的上下壁杆间，Y轴托盘上放置微孔板，通过U型臂的移动，U型臂上下的接收器和发射器读取信息，计算微孔板微孔内液体的浑浊度，进而得知微孔板每个孔内部微生物生长情况，简单方便地得知微孔内微生物的信息，进而方便了研究者筛选；
本发明基于自动挑菌仪提供的用于单个菌株的获取的筛选方法，通过使用自动挑菌仪进行筛选，从复杂样品中将单个菌株分离出来，获得了有明显生长的单个菌株，以便研究者对单个菌株的研究。
附图说明
图1为本发明的结构示意图；
图2为本发明去除上壳体前安全挡板后的示意图；
图3为本发明的浊度计示意图；
图4为本发明浊度计去除遮光罩后的示意图；
图5为本发明浊度计去除遮光罩后的俯视图。
图中：1、移液工作站；11、液体抽吸模块；111、移液头；112、抽吸杆；12、Y轴托盘；13、上壳体；14、X轴驱动器；15、载物板；16、Y轴驱动器；17、板位区；18、废料槽；2、浊度计；201、步进电机；202、U型臂；203、发射器；204、接收器；205、左侧板；206、右侧板；207、底板；208、前连接板；209、后连接板；210、遮光罩；211、螺杆；212、限位杆；213、传动齿轮；214、初始位传感器；215、控制电路板；216、USB接口。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明作进一步阐述。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。另外，本发明的X轴方向指示的是载物板长度方向，Y轴方向指示的是载物板的宽度方向，Z轴方向指示的是垂直于载物板的方向，即竖直方向。
实施例1
一种自动挑菌仪，包括：
移液工作站1，如图1-2所示，移液工作站1包括液体抽吸模块11和Y轴托盘12，液体抽吸模块11安装在移液工作站1的上壳体13内，液体抽吸模块11由X轴驱动器14带动实现X轴移动，Y轴托盘12安装在移液工作站1底端的载物板15上，Y轴托盘12由Y轴驱动器16带动实现Y轴移动，Y轴托盘12上设有9个板位区17，位于左下角的板位区17为中空结构，左下角的板位区17内安装有微孔板，本实施例微孔板上有384个微孔。液体抽吸模块11包括多个移液头111，移液头111由抽吸杆112带动实现液体的抽吸；载物板15上设有废料槽18。
浊度计2，如图1、3、4和5所示，浊度计2安装在左下角的板位区17外侧，浊度计2包括由步进电机201带动实现Y轴移动的U型臂202，Y轴托盘12位于U型臂202的上下壁杆间，U型臂202的上下壁杆上分别设有发射器203和与发射器203配合的接收器204；发射器203采用带有准直透镜的650nm半导体激光器，接收器204采用CdS光敏电阻。
浊度计2还包括构成浊度计骨架的左侧板205、右侧板206、底板207、前连接板208和后连接板209，步进电机201和U型臂202位于骨架内，骨架上侧设有遮光罩210。左侧板205和右侧板206间设有螺杆211和限位杆212，步进电机201通过传动齿轮213连接螺杆211，螺杆211穿过U型臂202下侧的螺纹孔与U型臂202螺纹连接，限位杆212穿过U型臂202下侧的通孔。后连接板209上靠近左侧板205端设有初始位传感器214，底板上207设有控制电路板215，右侧板206上设有连接控制电路板215的USB接口216。
控制系统，控制系统包括控制器，控制器与移液工作站和浊度计的信号连接，控制器为常规的单片机，植入程序控制移液工作站和浊度计的运行，本实施例选用AtmelATmega328p式单片机。具体的，对于移液工作站1，单片机控制液体抽吸模块11的液体抽吸，单片机控制X轴驱动器14带动液体抽吸模块11在X轴方向移动，单片机控制Y轴托盘12在Y轴方向移动；对于浊度计2，单片机控制发射器203发射光线，根据接收器204的接收信息计算微孔中液体的浑浊度，单片机控制步进电机201带动U型臂202在Y轴方向移动读取微孔中液体信息。
实施例2
本实施例在实施例1的基础上，提供了一种基于实施例1自动挑菌仪筛选单个菌株的筛选方法，本实施例的原始样品为含有肠道厌氧菌的复杂样品，本实施例的目的是获取原始样品中的有明显生长的单个菌株，本实施例的方法包括以下几个步骤：
步骤S1，准备原始样品，用自动挑菌仪的移液工作站将原始样品稀释，将稀释后的原始样品加入YCFA培养基，得到培养基样品，用自动挑菌仪的移液工作站将培养基样品分装到384微孔板的微孔中；
步骤S2，将微孔板内的培养基样品，在自动挑菌仪外的恒温培养箱中培养5天后目标菌株生长，恒温培养箱中的培养温度为37℃；
步骤S3，将培养完成的培养基样品，用自动挑菌仪上的浊度计，读取微孔板上每个微孔中培养基的浊度值，并生成挑取文件；
步骤S4，自动挑菌仪根据挑取文件中浊度计检测结果，设定移液工作站挑菌最小OD值，移液工作站对大于最小OD值的微孔中的培养基进行挑取，得到单个菌株。
筛选的条件和筛选后的结果如表1所示：
表1肠道厌氧菌株的筛选
通过使用挑菌仪筛选微生物，微生物菌株的分离通量可达到100-400个/小时，应用MALDI-TOF和/或PCR测序上述表中挑取后菌株的16S rRNA基因，发现纯菌比例在80％以上。
上述步骤S1和S4中，自动挑菌仪进行稀释和挑取是利用移液工作站1的液体抽吸模块11的移液头111实现的，移液头111设置有多个，微孔板放置在Y轴托盘12上，微孔板上均匀设置有多个微孔，由Y轴驱动器16带动Y轴托盘上的微孔板在Y轴方向移动，由X轴驱动器14带动液体抽吸模块11的移液头111在X轴方向移动，由Z轴驱动器带动移液头111在竖直方向移动，通过三轴联动，移液头111对微孔板上微孔内的液体进行稀释和挑取。
上述步骤S3中，浊度计读取微孔板每个微孔中培养基的浊度值包括以下几个步骤：
步骤S31，将微孔板放置于Y轴托盘12的左下角位，浊度计2的U型臂202首先初始化回到初始位传感器214处，此时微孔板不在发射器和接收器之间，发射器203不工作，读取接收器204的信号并传给控制系统，控制系统将此时的信号定位透射度零点；然后发射器203工作，接收器204接收信号并传给控制系统，此时的信号定位透射度满点；透射度的满点和零点用于计算液体的透过率。
步骤S32，Y轴托盘12上的微孔板由Y轴驱动器16带动向浊度计2方向移动，当微孔板的第一排孔处于U型臂202下部的发射器203正上方后停止移动，然后U型臂202由步进电机201带动按照设定的程序由初始位置向远端逐步移动，即向X轴方向移动，当U型臂202每到达一个孔下方后，利用接收器204接收到的发射器203发出的光线信号，将该信号传给控制器，控制器将该信号与零点和满点作比较，计算成该孔的透射率，然后换算成光密度，本实施例中，控制器为单片机。
步骤S31，重复步骤S31-S32，完成对整个微孔板的读取，并由控制器生成挑取文件。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.一种自动挑菌仪，其特征在于，包括：
移液工作站(1)，所述移液工作站(1)包括液体抽吸模块(11)和Y轴托盘(12)，所述液体抽吸模块(11)安装在移液工作站(1)的上壳体(13)内，液体抽吸模块(11)由X轴驱动器(14)带动，所述Y轴托盘(12)安装在移液工作站(1)底端的载物板(15)上，Y轴托盘(12)由Y轴驱动器(16)带动，所述Y轴托盘(12)上设有多个板位区(17)，位于左下角的板位区(17)为中空结构；
浊度计(2)，所述浊度计(2)安装在左下角的板位区(17)外侧，所述浊度计(2)包括由步进电机(201)带动的U型臂(202)，Y轴托盘(12)位于所述U型臂(202)的上下壁杆间，所述U型臂(202)的上下壁杆上分别设有发射器(203)和与发射器(203)配合的接收器(204)；
控制系统，所述控制系统包括控制器，所述控制器与移液工作站(1)和浊度计(2)的信号连接；
所述浊度计(2)还包括构成浊度计骨架的左侧板(205)、右侧板(206)、底板(207)、前连接板(208)和后连接板(209)，所述步进电机(201)和U型臂(202)位于骨架内，所述骨架上侧设有遮光罩(210)；
所述左侧板(205)和右侧板(206)间设有螺杆(211)和限位杆(212)，所述步进电机(201)通过传动齿轮(213)连接螺杆(211)，所述螺杆(211)穿过U型臂(202)下侧的螺纹孔与U型臂(202)螺纹连接，所述限位杆(212)穿过U型臂(202)下侧的通孔；
所述后连接板(209)上靠近左侧板(205)端设有初始位传感器(214)，所述底板(207)上设有控制电路板(215)，右侧板(206)上设有连接控制电路板(215)的USB接口(216)。
2.根据权利要求1所述的一种自动挑菌仪，其特征在于，所述发射器(203)采用600-605nm LED及透镜组进行发射光准直或是带有准直透镜的650nm半导体激光器，所述接收器(204)采用CdS光敏电阻。
3.根据权利要求1所述的一种自动挑菌仪，其特征在于，所述液体抽吸模块(11)包括多个移液头(111)，所述移液头(111)由抽吸杆(112)带动实现液体的抽吸。
4.根据权利要求1所述的一种自动挑菌仪，其特征在于，所述载物板(15)上设有废料槽(18)。
5.一种采用权利要求1所述自动挑菌仪的微生物筛选方法，其特征在于，该方法用于单个菌株的获取，包括以下步骤：
步骤S1，准备原始样品，用自动挑菌仪的移液工作站将原始样品稀释，将稀释后的原始样品加入培养基，得到培养基样品，用自动挑菌仪的移液工作站将培养基样品分装到微孔板的微孔中；
步骤S2，将步骤S1中微孔板内的培养基样品，在目标菌株生长的温度下恒温培养至目标菌株生长；
步骤S3，将步骤S2中培养完成的培养基样品，用自动挑菌仪上的浊度计，读取微孔板上每个微孔中培养基的浊度值，并生成挑取文件；
步骤S4，自动挑菌仪根据挑取文件中浊度计检测结果，设定移液工作站挑菌最小OD值，移液工作站对大于最小OD值的微孔中的培养基进行挑取，得到单个菌株。
6.根据权利要求5所述的自动挑菌仪的微生物筛选方法，其特征在于，上述步骤S3中，浊度计读取微孔板上每个微孔中培养基的浊度值包括以下步骤：
步骤S31，将微孔板放置于Y轴托盘(12)的左下角位，浊度计的U型臂(202)初始化回到初始位传感器(214)处，并读取无光照和光照无板时的信号，定为透射度的零点和满点，用于计算透射率；
步骤S32，Y轴托盘(12)向浊度计方向移动，当移动到微孔板的第一排孔处于U型臂(202)下部的光源正上方后停止移动，然后U型臂(202)按照设定的程序由初始位置向远端逐步移动，每到达一个孔下方后控制器读取该孔的透射率，并换算成光密度值；
步骤S33，重复步骤S31-S32，浊度计完成对整个微孔板的读取，并由控制器生成挑取文件。
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