CN103361357A - 一种高山离子芥抗冻蛋白及其编码序列与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高山离子芥抗冻蛋白CbCOR15，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种编码上述蛋白的基因CbCOR15，它具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。本发明的高山离子芥抗冻蛋白的编码基因CbCOR15可用于转化植物以产生抗冻转基因植物。

Description

一种高山离子芥抗冻蛋白及其编码序列与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高山离子芥抗冻蛋白及其编码序列在提高烟草抗冻性中的应用。

背景技术

COR（Cold responsive）基因编码一类受低温诱导而产生的蛋白，对防止脱水和稳定细胞内环境有一定的作用。目前对拟南芥COR15基因家族中的COR15a研究比较深入，编码一种分子量为15000 道尔顿的蛋白，2.5℃诱导2h后产生，进入叶绿体后又去掉导肽形成分子量为9400 道尔顿的多肽（COR15am），在零下低温的胁迫时对叶绿体膜起稳定作用（Leslie A. Wanner and Olavi Junttila，1999，Plant Physiol.）。COR15a在转基因植物中组成表达后，含COR15am蛋白的转基因植物中的叶绿体比野生型植物中不含COR15am蛋白的叶绿体更具耐冻性(Murray Webb et al., 1996，Plant Physiol.)，而且COR15a的表达能增加原生质膜的低温稳定性(ArtusNN et al., 1996, ProcNatl Acad Sci USA)。 进一步的研究表明，COR15am蛋白在离体条件下可以增加膜脂分子的稳定性。

高山离子芥（Chorispora bungeana）是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、空气稀薄、辐射强、劲风。高山离子芥在我国主要分布于乌鲁木齐河源区流石碓，该地区海拔3600～3900m。年平均气温在-5～-7℃之间，6～8月平均气温为3.6℃，气温日差较大，是一种伴随反复冻融的冰冻环境。并且处于迎风坡，流石碓中砾石保水性差，时常造成干旱胁迫。高山离子芥在外部形态结构和生态策略上没有显著的抗性特征，为了耐受长期低温、强紫外、大风和生理干旱，适应这些不利的环境条件，势必通过表达抗性基因来维持自身的生理代谢和生长发育，以避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。

高山离子芥与拟南芥同属于十字花科，两者的基因组具有较高的保守性。由于高山离子芥处于冰缘环境，积累了适应低温的有益突变，所以克隆高山离子芥的抗冻基因CbCOR15并应用到转基因作物中提高其抗冻性具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的高山离子芥CbCOR15基因。

本发明的另一个目的在于提供一种培育抗冻转基因植物的方法，是将所述的编码基因转入植物中，得到抗冻的转基因植物。

本发明的又一个目的在于提供一种由所述CbCOR15基因用于转化植物以产生转基因植物的用途。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明采用RACE技术克隆了高山离子芥的CbCOR15基因，所述CbCOR15基因具有SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列，基因全长612个碱基，包含一个 423个碱基的开放阅读框，此外，起始密码子前面有83个碱基长的5’非翻译区，编码区后面有106个碱基的包含poly（A）的3’非翻译区。CbCOR15能够编码CbCOR15蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO：2由140个氨基酸组成。

高山离子芥CbCOR15基因编码的蛋白序列和其他植物的COR15蛋白序列进行比较发现：它与小拟南芥ApCOR15a具有最高的同源性70.71%（图1）。其次是荠菜CbCOR15，同源性为66.67%；拟南芥AtCOR15b，65.25%；AtCOR15a，63.57%；油菜BN115，61.97%。

本发明对CbCOR15基因进行了鉴定。将高山离子芥的愈伤组织在-4 ^oC处理不同时间，收集材料，并提取RNA。之后将RNA反转录成cDNA，进行RT-PCR，根据得到的Ct值，利用Pfaffl method（Pfaffl，2001）来计算在零下-4 ^oC不同的处理时间CbCOR15基因表达量的变化，结果见图2，由图可知，4 ^oC处理时CbCOR15 mRNA的积累量在第6天达到最大，而-4 ^oC处理时CbCOR15 mRNA的积累量在第4天达到最大。在两种处理下CbCOR15 mRNA的积累量在第7天仍保持很高水平。可以发现与4 ^oC和0 ^oC处理相比，CbCOR15 mRNA的积累在-4 ^oC处理时增加的更加迅速和直接。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有CbCOR15基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PMDC32、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。携带有CbCOR15的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri 质粒、植物病毒载体、直接DNA 转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥等双子叶植物。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GFP基因、GUS基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因(如抗除芳剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明所提供的耐低温的转基因植物的方法，是将CbCOR15基因导入植物中，得到抗冻的转基因植物。

本发明将CbCOR15基因的cDNA构建在PBI121-35S-CbCOR15启动子下游，得到表达载体（其图谱如图3所示），利用电击转化的方法即得到含有该表达载体的农杆菌菌株，利用花序浸染的方法转染野生型拟南芥得到过表达的转基因植株。所述植物可为双子叶植物，如烟草。

本发明验证了转基因植株的耐低温，结果显示（图4），CbCOR15过表达的转基因烟草在-4 ^oC的离子渗透率远低于野生型，说明由于CbCOR15蛋白的过表达降低了植物细胞受到低温的损伤，即CbCOR15蛋白的过表达可以增强植物的抗冻性。这对于培养优良的作物品种特别是抗冻的作物品种具有重要的理论及实践意义。

附图说明

图1 高山离子芥CbCOR15蛋白的氨基酸序列在NCBI同源性比对。

图2 高山离子芥在不同低温下、不同处理时间的表达量变化。

图3 构建的过表达载体PBI121-35S-CbCOR15图谱。

图4 对照和转基因植株抗冻性的比较：2℃冷胁迫处理7天前后转基因植株和对照植株相对电导率、叶绿素含量、MDA含量和相对含水量的测定。NT，对照烟草植株；A5，A15，CbCOR15转基因烟草植株；M9，M17，CbCOR15m转基因烟草植株。

具体实施方式

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为高山离子芥（Chrisporabungeana) (西部植物种质资源库数据平台）和烟草（Nicotiana tabacum）。

实施例 1

高山离子芥冷诱导蛋白编码基因CbCOR15序列的克隆：

利用RNA提取分离试剂（Trizol，Invitrogen）分离高山离子芥愈伤组织总RNA，其具体方法是：收集高山离子芥愈伤组织100 mg，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1 ml Trizol试剂，充分混匀，吸入到一个1.5 ml的离心管中；室温放置5min；加入0.2 ml新鲜氯仿，剧烈振摇15 s，室温静置3 min；4 ^oC，12000 g离心15 min；上清水相转移到一个新的1.5 ml离心管中，加入0.5 ml异丙醇混匀，4 ^oC，12000 g离心10 min沉淀RNA；RNA沉淀用1 ml 75%乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-70 ^oC保存备用。

根据GeneBank中公布的植物铁转运蛋白基因的序列设计兼并引物扩增CDS的保守区（B=T+G+C；Y =T +C；D =A +T+G；N = A+ C+G +T；R =A +G），得到487 bp的目的片段。根据第一次克隆片段的测序结果和序列比对结果，以拟南芥的铁转运蛋白基因为模板设计了P3和P4引物。以P3和FED1为引物进行扩增得到第一条目的条带。另一端以FEU2和P4引物扩增得到第二条目的条带。将三次PCR产物测序结果进行拼接，得到完整的CDS序列。所述冷诱导基因CbCOR15具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，基因全长612个碱基，包含一个423碱基的开放阅读框，此外，起始密码子前面有83个碱基长的5’非翻译区，编码区后面有106个碱基的包含poly（A）的3’非翻译区。该冷诱导基因CbCOR15的编码基因能够编码CbCOR15蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO：2由140个氨基酸组成。

高山离子芥CbCOR15基因编码的蛋白序列和其他植物的COR15蛋白序列进行比较发现：它与小拟南芥ApCOR15a具有最高的同源性70.71%（图1）。其次是荠菜CbCOR15，同源性为66.67%；拟南芥AtCOR15b，65.25%；AtCOR15a，63.57%；油菜BN115，61.97%。

CDS的保守区扩增引物：

P1：5- GYTCGTCGYCGTYKCTCARCGC-3

P2：5- CCCTCYRCGAACTCSGCCGC-3

Race引物：

P3：5- GAGAAAGATGGCAACATCCTCG-3

FED1：5- GGAGCTGAGAGATTCCGTTGC-3

FEU2：5- GAAGCATTTCCTGTGGACAATCGA-3

P4：5- TGGTGGCATCCTTAGCATCTC-3

实施例 2

高山离子芥冷诱导基因CbCOR15的鉴定

通过生物信息学的方法进行序列分析，设计Real-time PCR的引物序列

CbCOR15基因

上游引物：5-GGAAAGTCCTACCAGCATTG-3

下游引物：5-ATCTATTGTCTCCCACGAAG-3

在零下4度处理离子芥的愈伤组织，分别在0，12，24，36，48，72，96，120小时，收集材料，提取RNA进行反转录成cDNA（方法同实施例1），按照 iQ™ SYBR® Green Supermix（Bio-Rad）试剂的说明预混反应试剂（1 ml cDNA 模版，10 ml Supermix，浓度为10 mM的上、下游引物各1 ml，7 ml 去离子水）。PCR反应程序：94 °C 预变性2min后进入扩增程序：94 °C 30 sec、57 °C 10 sec、72°C 20 ecs 40个循环，后进入溶解程序：由60 °C升到95 °C，每个温度保温10 sec。根据得到的Ct值，利用Pfaffl method（Pfaffl, 2001）来计算在零下4度不同的处理时间CbCOR15基因表达量的变化，结果见图4， 4 °C处理时CbCOR15 mRNA的积累量在第6天达到最大，而-4 °C处理时CbCOR15 mRNA的积累量在第4天达到最大。在两种处理下CbCOR15 mRNA的积累量在第7天仍保持很高水平。可以发现与4 °C和0 °C处理相比，CbCOR15 mRNA的积累在-4 °C处理时增加的更加迅速和直接。结果证明CbCOR15是一种高山离子芥冷诱导基因，与高山离子芥的抗冻性密切相关。

实施例 3

转CbCOR15基因植株的培育及抗冻性的测定

构建真核表达载体PBI121-35S-CbCOR15（其图谱如图3所示），转化农杆菌LBA4404，利用叶盘法转化烟草。具体方法如下:从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3ml YEP 液体培养基中（Rif 4011 g/ml、Kan 100 μg/ml）于恒温摇床上28 ^oC，180 rpm 暗培过夜至OD₆₀₀为0.6-0.8。摇培过夜的菌液按1% -2%（v/v）的比例，转入新配置的含有相应抗生素的YEP 培养基中，在与上述相同的条件下培养6 h左右， OD₆₀₀为0. 5左右。5000rpm 离心十分钟收集菌沉淀，用50 ml YEP 液体培养基重悬沉淀。取野生型烟草无茵茵的幼嫩叶片，去主脉，将叶片剪成0.5 cm²的小块，放入菌液中，浸泡10 min（其间不断摇动菌液使其侵染充分）。

取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。将侵染后的烟草叶片接种在MS+KT（2.0 μg/ml）+IAA（1.0 μg/ml）固体培养基上，28 ^oC暗培养三天。将黑暗中共培养2-4天的烟草叶片转移到MS+KT（2.0 μg /ml）+ IAA（1.0 μg /ml）+Kan（100 μg/ml）+ Cef（200 μg/ml）中，用封口膜封好培养皿，在光照为30001 μx、28 ^oC、16 h/8 h光暗条件下选择培养。约2-3周后，持不定芽长到1 cm左右时，切下不定芽并转移到MS+Kan（200 μg /ml）+ Cef（200 μg /ml）上进行生根培养，获得完整植株。

提取转化烟草的总DNA，PCR检测CbCOR15基因是否转入，对扩增出合适条带的植株进一步提取总RNA，获得cDNA，以cDNA为模板进一步进行PCR检测，鉴定转化成功的转基因植株。

细胞膜的选择透性是维持细胞生理功能的最重要的条件之一，低温冻害会造成细胞膜的机械损伤和膜脂过氧化作用，从而增大细胞膜的通透性。细胞质膜透性的测定常作为植物抗逆研究中的一个重要生理指标。当质膜的选择透性因逆境伤害而明显改变或丧失时，细胞内的物质(尤其是电解质)大量外渗，从而引起组织浸泡液的电导率发生变化，通过测定外渗液电导率的变化，就可反映出质膜的伤害程度和所测材料抗逆性的大小。Dexter (1930)首先用电导法测定了植物的抗冻性，经过不断地改进和完善，目前已得到广泛应用。研究显示，将基因转入植株中，如果该植株细胞在低温下的渗透性降低，说明该植株细胞受到的低温损害小，其抗冻性得到增强，可以证明该基因与植物的抗冻性有关。

将CbCOR15过表达的转基因烟草在零下2度处理7天后，发现转基因烟草离子渗透率远低于野生型，说明由于CbCOR15蛋白的过表达降低了植物细胞受到低温的损伤，即CbCOR15蛋白的过表达可以增强植物的抗冻性。这对于培养优良的作物品种特别是抗冻的作物品种具有重要的理论及实践意义。

Claims (8)

1.一种提高植物抗冻性的基因CbCOR15，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的基因在用于转基因植物育种中的用途。

3.含有权利要求1所述基因的表达载体、细胞系及宿主菌。

4.一种培育抗冻转基因植物的方法，是将权利要求1所述的编码基因转入植物中，得到抗冻转基因植物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：权利要求1所述的编码基因是通过权利要求3所述的重组表达载体导入植物中。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述植物为烟草。

8.一种由权利要求1所述的基因CbCOR15编码的蛋白质CbCOR15，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

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