CN101979582A

CN101979582A - 一个编码冰缘植物冷诱导蛋白的基因及其在抗寒转基因烟草中的应用

Info

Publication number: CN101979582A
Application number: CN 201010234983
Authority: CN
Inventors: 安黎哲; 孙正龙; 关淼; 杨玉; 白慕群; 陈书燕; 盛红梅; 张华�; 向云
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2010-07-20
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2011-02-23

Abstract

本发明公开了一个高山离子芥冷诱导基因CbDRH，编码产物及其在抗寒转基因烟草中的应用。高山离子芥冷诱导的基因CbDRH是下列核苷酸序列之一：1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。由上述基因CbDRH编码的蛋白质，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。该基因在低温下蛋白水平上调了7倍，转入CbDRH基因的转基因烟草在低温下比野生型烟草具有更高的抗寒性。这对于培育抗低温的优良作物具有重要的理论及实际意义。

Description

一个编码冰缘植物冷诱导蛋白的基因及其在抗寒转基因烟草中的应用

技术领域

本发明涉及一个编码冰缘植物冷诱导蛋白的基因，特别是涉及一个编码高山离子芥冷诱导的DEAD-box RNA解旋酶的基因，及其在抗寒转基因烟草中的应用。

背景技术

DEAD-box RNA解旋酶存在于从原核的细菌到真核的动植物的绝大多数生物中。这些蛋白能够利用ATP水解释放的能量改变RNA的次级结构或者移走绑定的蛋白，从而帮助RNA形成正确的折叠形式。DEAD-box RNA解旋酶参与很多的RNA代谢过程，包括转录，前体RNA的剪切，核糖体生物发生，RNA出核运输，翻译起始，细胞器基因表达，RNA降解等多种生理过程(Rocak S andLinder P，2004，Nature Rev.Mol.Cell Biol.)。在模式植物拟南芥中，DEAD-box RNA解旋酶基因组成一个含有58个成员的家族，即AtRH1-AtRH58(Aubourg S，Kreis M，et al，1999，Nucleic Acides Research)。近年来，人们发现DEAD-box RNA解旋酶参与高等植物胁迫应答，包括低温胁迫，热胁迫，盐胁迫，渗透胁迫以及氧化胁迫。例如已经发现拟南芥DEAD-boxRNA解旋酶FL2-5A4，PMH1，PMH2，以及大麦DEAD-box RNA解旋酶HVD1在低温胁迫下表达量增高，在烟草中过表达一个DEAD-box RNA解旋酶PDH45增强了烟草的耐盐性(Sanan-Mirshra N，Pham X H，Sopory S K，et al，2005，Proc.Natl Acad.Sci.)。

高山离子芥(Chorispora bungeana)是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其生存环境的特点是气候寒冷、土层反复冻融，空气稀薄、辐射强、劲风。高山离子芥在外部形态结构和生态策略上没有显著的抗性特征，为了耐受长期低温、反复冻融，强紫外、大风等不利的环境条件，势必通过表达抗性基因来维持自身的生理代谢和生长发育，以避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。因此高山离子芥是理想的研究植物抗性的的材料。

为探索高山离子芥适应低温胁迫的内在机制，本实验室利用蛋白质组学的方法，分析高山离子芥在低温胁迫(0℃)和常温(20℃)下的蛋白表达差异。用TCA-丙酮法分别提取无菌苗的总蛋白，进行双向电泳，对凝胶进行胶体考染并脱色，利用PDQUEST8.0软件对电泳结果进行分析，发现其中一个蛋白在低温胁迫下(0℃)积累量是正常条件(20℃)的7倍，质谱分析表明该蛋白属于DEAD-box RNA解旋酶家族，我们将该蛋白命名为CbDRH(Chorisporabungeana DRH，CbDRH)。我们利用RACE技术，获得编码CbDRH基因全cds区。序列比对分析表明CbDRH与拟南芥AtRH30同源性最高，达90％。目前，在拟南芥中还未见到关于AtRH30功能的报道。克隆该基因并应用到转基因植物上对于培育抵抗低温的优良作物具有一定的价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种高山离子芥DRH冷诱导蛋白基因及其编码产物。本发明的另一目的提供高山离子芥DRH冷诱导蛋白基因在抗冻转基因烟草中的应用。

(a)一种高山离子芥DRH(Chorispora bungeana DRH，CbDRH)基因编码序列，该基因包含1452个核苷酸，编码484个氨基酸，其分子量为52.66KD。其核苷酸序列为序列表中序列(a)所述，以下为核苷酸序列。

ATGAGCTCCTATGATCGTAGATTTGCTGATCCGAATTCGTATCGCCAACGCTCTGGCGCCCCAGTT

GGTCCATCTCAGCCAATGGATCCTTCTGCTGCACCGTACAATCCACGATACGGTGGTGGTGGTGGA

TATGGACCGTCTCCTGTAATGGCCGGTGATGGCTCCGGGTATAGTCGGTACCCAGCTTTCCAGCCA

CCTACTAGTGGTTTCTCCGTTGGTCGCGGCGGAGGAGGAGGAAGAGGCACATATGGTCAATACGGC

GGCGGAGGAGGCGGCGGCAGTGGTGGGAATTGGGGAGGACGTGGTGGTGGATCGAATAAAAGAGAG

CTAGATAATGTTTCGCTTCCGAAGCAGAATTTTGGGAATCTTGTCCATTTCGAGAAGAATTTCTAC

GTGGAAAGCCCCGATGTGCAGGCGATGACAGAACAGGATGTTGCGATGTATAGAACCGGGAGGGAT

ATATCCGTTGAAGGTCGTGATGTTCCTAAGCCGATTAGGATGTTCCAAGATGCTAACTTCCCAGAT

AATATTCTCGAAGCGATTGCTAAGTTGGGATTCACTGAGCCAACACCGATACAATCTCAGGGATGG

CCAATGGCTTTGAAGGGTAGGGATCTGATTGGTATTGCTGAGACTGGCTCTGGTAAGACATTAGCT

TACTTGTTACCAGCGTTGGTCCACGTAAGCGCACAACCTCGATTGAGTCAAGATGATGGCCCCATT

GTGTTAATATTAGCGCCCACTAGAGAATTAGCTGTTCAGATTCAAGAGGAATCAAGGAAATTCGGT

CTGCGATCTGGTGTTAGAAGCACTTGTATCTATGGTGGTGCTCCTAAAGGACCTCAGATTCGCGAT

CTTAGAAGAGGTGTTGAGATTGTAATTGCTACACCTGGTCGTTTGATCGATATGTTGGAGTGTCAA

CATACTAATTTGAGGAGAGTAACTTACCTCGTGTTAGATGAAGCTGACCGAATGTTAGACATGGGA

TTTGAACCCCAAATTAGAAAGATTGTATCTCAGATCCGACCTGATAGACAGACGCTGCTTTGGAGT

6CAACATGGCCACGAGAGGTTGAATCTCTTGCCAGGCAGTTTCTACGAGATCCATATAAGGCCATT

ATTGGATCAGCAGATCTAAAAGCTAACCAGTCTATTAATCAAGTAATCGAGATTGTACCAACGCCA

GAGAAATACGCCAGGCTTCTTGCACTGCTTAAACAGTTAATGGATGGGAGTAAAATCCTAATATTC

GTGGAGACAAAGAGAGGGTGTGATCAAGTGACTAGACAATTGAGAATGGATGGATGGCCAGCTCTA

GCCATACACGGTGACAAGAACCAATCGGAAAGAGATCGAGTCTTGTCAGAATTTAAGAGCGGAAGA

AGCCCGATAATGACTGCCACTGATGTAGCAGCAAGGGGACTTGGTAGGACAACTGTAACACAATAG

(b)一种高山离子芥DEAD-box RNA解旋酶(CbDRH)蛋白的氨基酸序列，该氨基酸序列包含DEAD-box蛋白家族特征性的八个保守基序，因此属于DEAD-box蛋白家族成员。CbDRH氨基酸序列如序列表中序列2所述，以下为氨基酸序列。

MSSYDRRFADPNSYRQRSGAPVGPSQPMDPSAAPYNPRYGGGGGYGPSPVMAGDGSGYSRYPAFQP

PTSGFSVGRGGGGGRGTYGQYGGGGGGGSGGNWGGRGGGSNKRELDNVSLPKQNFGNLVHFEKNFY

VESPDVQAMTEQDVAMYRTGRDISVEGRDVPKPIRMFQDANFPDNILEAIAKLGFTEPTPIQSQGW

PMALKGRDLIGIAETGSGKTLAYLLPALVHVSAQPRLSQDDGPIVLILAPTRELAVQIQEESRKFG

LRSGVRSTCIYGGAPKGPQIRDLRRGVEIVIATPGRLIDMLECQHTNLRRVTYLVLDEADRMLDMG

FEPQIRKIVSQIRPDRQTLLWSATWPREVESLARQFLRDPYKAIIGSADLKANQSINQVIEIVPTP

EKYARLLALLKQLMDGSKILIFVETKRGCDQVTRQLRMDGWPALAIHGDKNQSERDRVLSEFKSGR

SPIMTATDVAARGLGRTTVTQ.

本发明中的cbDRH基因和拟南芥AtRH30的DNA序列具有90％同源性，推测编码相似功能蛋白质，蛋白序列的同源性也为90％。

本发明序列(a)的DNA序列有1452个碱基组成，编码序列表中由483个氨基酸残基组成的蛋白质序列(b)。双向电泳检测到CbDRH蛋白在低温胁迫下(0℃)积累量是正常条件(20℃)的7倍。

含有本发明基因CbDRH的表达载体及细胞系也在本发明的保护范围之内。利用PCR技术得到CbDRH基因全cds区，并在两端分别引入SmaI和XbaI酶切位点，连接到克隆载体PMD18-T上，用SmaI和XbaI在37℃酶切过夜，回收目的基因片段。将带有35s启动子的PBI121质粒用同样的方法酶切过夜，并回收酶切产物。将回收的目的基因与回收的PBI121载体用T4 DNA连接酶于20℃连接过夜，次日将连接体系转化大肠杆菌DH5-a，菌落PCR筛选阳性克隆并送去测序，经测序鉴定正确的克隆为含有真核表达载体PBI121-35s-CbDRH的克隆。提取质粒PBI121-35s-CbDRH，通过转化农杆菌LBA4404即得到含有该表达载体的农杆菌菌株。

利用农杆菌介导的转化，将表达载体转入烟草，经过筛选获得组成型表达CbDRH基因的转基因烟草。检测转基因植株的抗低温能力，结果表明转基因植株的抗低温能力远大于野生型。在冷胁迫下，转基因烟草的叶绿素含量高于对照，同时，转基因烟草比对照积累更多的脯氨酸；在短时间冻胁迫(-4℃处理12小时)下，转基因烟草的质膜渗漏率小于对照。

附图说明

图1示低温处理前后转CbDRH基因烟草TL3和野生型对照生长状态。a为25℃生长状态，b为-4℃，处理12hours后生长状态。WT：野生型对照；TL3：转基因植株。图1显示转入CbDRH基因的烟草在低温下生长状态明显好于野生型对照。-4℃处理12hours，野生型对照烟草已经萎蔫，而转基因植株生长状态良好。

图2示低温处理前后转CbDRH基因植株TL3和野生型对照的质膜离子渗漏率变化。WT：野生型对照；TL3：转基因植株。25℃下转基因TL3植株的质膜离子渗漏率与野生型无明显变化；4℃处理3天转基因植株TL3的质膜离子渗漏率与野生型亦无明显变化；-4℃处理12hours后，野生型对照植株的质膜离子渗漏率是转基因植株TL3的3倍。显示-4℃低温下野生型对照植株受到的伤害远大于转基因植株。

具体实施方式

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为高山离子芥(Chorisporabungeana)和烟草(Nicotiana tabacum)。

实施例1

高山离子芥CbDRH基因克隆

1.高山离子芥CbDRH基因3’端扩增

1.1.利用Trizol法分离0℃处理一周的高山离子芥叶片中总RNA，其具体方法是：将高山离子芥叶片0.05g放入研钵，加液氮覆盖材料，迅速用力研成粉末，加入1ml Trizol，研磨至溶化，转移到灭菌的ep管中。12000g×5min，4℃离心。取上清，转移到新的ep管中，加五分之一体积的氯仿，剧烈震荡15s，室温放置10min，待其分层。12000g×15min，4℃。用枪从表面慢慢往下吸，取上层水相转移至另一新的ep管中，一般取300-400ul足够(切勿碰到下层)，用枪从表面慢慢往下吸，最后应距下层0.4cm左右。在ep管加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min，12000g×10min，4℃。弃上清，加冰浴的75％乙醇(用DEPC水配)1ml，轻轻吹悬吹散。10000g×8min，4℃。弃乙醇，吸干，残余的微量乙醇空气干燥(不能太干，否则不易溶解)。用20-30ulDEPC水溶解。少量用于电泳检测，其余-80℃保存。

1.2根据生物信息学提供的序列资料设计以下特异性引物：

Outer primer：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’；

Inner Primer：5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’

1.3根据TaKaRa的RACE试剂盒设计程序，进行PCR反应。PCR扩增步骤如下：(1)Outer PCR反应。反应体系为，模板，2ul；1×cDNA dilution bufferII，8ul；Gene specific outer primer(10uM)，2ul；3’RACE outer primer(10uM)，2ul；10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺free)，4ul；MgCl₂(25mM)，3ul；LA Taq(5U/ul)，0.25ul；ddH₂O，28.75ul；反应条件为，94℃，3min；94℃，30s；55℃，30s 72℃，1min(30循环)；72℃，10min；4℃保存。(2)Inner PCR反应。反应体系为，Outer PCR产物，1ul；dNTPmixture(2.5mM each)，8ul；10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺free)，5ul；MgCl₂(25mM)，5ul；LA Taq(5U/ul)，0.5ul；Gene specific innerprimer(10uM)，2ul；3’RACE inner primer(10uM)，2ul；ddH₂O，26.5ul。反应条件为，94℃，3min；94℃，30sec；55℃，30s；72℃，1min(30循环)，72℃10min；4℃保存。

2.高山离子芥DRH基因5’端扩增

2.1去磷酸化处理：按下列组分配制去磷酸化反应：Total RNA(1ug/ul)2ul；RNase inhibitor(40U/ul)：1ul；10×Alkaline phosphatasebuffer(MgCl₂ free)：5ul；Alkaline phosphatase(calfintestine)(16U/ul)，0.6ul；RNase free ddH₂O：up to 50ul；50℃反应1小时。向上述反应液中加入20ul的3M CH₃COONa(PH5.2)，130ul的RNasefree ddH₂O后，充分混匀。加入200ul的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25∶24∶1)，充分混匀后13000×g室温离心5min。将上层水相转移到新的Microtube中。加入200ul的氯仿，充分混匀后13000×g室温离心5min。将上层水相转移到新的Microtube中。加入2ul的NAcarrier后均匀混合。加入200ul的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10min。13000×g 4℃离心20min，弃上清。加入500ul的70％冷乙醇(RNase free ddH₂O配制)漂洗，离心5min，弃上清后干燥。加入7ul的RNase free ddH₂O溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。

2.2“去帽子”反应：配制“去帽子”反应液CIAP-treated RNA：7ul；RNase inhibitor(40U/ul)：1ul；10×Tap reaction buffer：1ul；Tobaccoacid pyrophosphatase(0.5U/ul)：1ul。37℃反应1小时此反应液中CIAP/TAP-treated RNA，取5ul用于5’RACE-Adaptor连接反应，剩余的5ul保存于-80℃。

2.3 5’RACE-Adaptor的连接。配溶液。CIAP/TAP-treated RNA：5ul；5’RACE-Adaptor(15ul)：1ul；RNase free ddH₂O：4ul；65℃保温5min后冰上放2min，然后加入下列试剂：RNase inhibitor(40U/ul)：1ul；5×RNA Ligation buffer：8ul；40％PEG 6000：20ul；T4 DNA ligase(40U/ul)：1ul。16℃反应1小时。向上述反应液中加入20ul的3M CH3COONa(PH5.2)，140ul的RNase free ddH₂O后，充分混匀。加入200ul的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀后13000×g室温离心5min。将上层水相转移到新的Microtube中。加入200ul的氯仿，充分混匀后13000×g室温离心5min。将上层水相转移到新的Microtube中。加入2ul的NAcarrier后均匀混合。加入200ul的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10min。13000×g 4℃离心20min，弃上清。加入500ul的70％冷乙醇(RNase free ddH2O配制)漂洗，离心5min，弃上清后干燥。再加入6ul的RNase free ddH₂O溶解沉淀，得到ligated RNA。

2.4反转录反应。反应体系为：ligated RNA，6ul；Random primer(50uM)，0.5ul；5×M-MLV Buffer，2ul；dNTP mixture(10mM each)，1μl；RNase inhibitor(40U/ul)，0.25ul；Reverse transcriptase M-MLV(RNaseH-)(200U/ul)，0.25ul。反应条件为：30℃，10min；42℃，1小时；70℃，15min。保存于-20℃。

2.5PCR反应。根据3’端测序结果，用Primer Premier软件设计5’端特异引物。(1)Outer PCR反应。反应体系为：5’特异性out primer(10uM)，2ul；5’RACE out primer(10uM)，2ul；cDNA模板，1ul；10×LA PCR BufferII(Mg²⁺free)，5ul；LA Taq(5U/ul)，0.5ul；MgCl₂(25mM)，5ul；dNTP(2.5mM)，8ul；ddH₂O，26.5ul。反应条件为94℃，2min；94℃，30s；72℃，2min(5循环)；94℃，30s；70℃，2min(5循环)；94℃，30s；66℃，30s；70℃ 2min(30循环)；68℃，10min；4℃保存。(2)Inner PCR反应。5’特异性inner primer(10uM)，2ul；5’RACE Inner primer(10uM)，2ul；Outer PCR反应液，1ul；LA Taq(5U/ul)，0.5ul；dNTP(2.5mM)，8ul；10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺free)，5ul；MgCl₂(25mM)，5ul；ddH₂O，26.5ul。反应条件为：94℃，30s；65℃，30s；68℃，2min(30循环)；68℃，5min；4℃保存。

3.基因拼接

3’端基因测序结果与5’端基因测序结果通过DNA MAN软件拼接，得到基因cDNA序列全长。

4.基因全长cDNA序列扩增

利用cDNA为模板，引物如下：

CbDRH-上CCATGGAAATGAGCTCCTATGATCGTAGAT，

CbDRH-下CTCGAGTTGTGTTACAGTTGTCCTACCAAGT。

PCR反应体系为：CbDRH-上，1ul；CbDRH-下，1ul；10×Taq buffer，2.5ul；cDNA模板，1ul；dNTP，2ul；Taq，1ul；MgCl₂(25mM)，2ul；ddH₂O，14.5ul。PCR反应条件为：95℃，3min；95℃，40s；60℃，40s；72℃2min(30循环)；4℃，∞。

扩增得到的CbDRH基因自起始密码子至终止密码子总长1452个碱基，编码483个氨基酸。

实施例2.

转基因烟草的获得

构建真核表达载体PBI121-35S-CbDRH，转化农杆菌LBA4404，利用叶盘法转化烟草。具体方法如下：从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3ml YEP液体培养基中(Rif 40μg/ml、Kan 100μg/ml)于恒温摇床上28℃，180rpm暗培过夜至OD 600为0.6-0.8。摇培过夜的菌液按1％-2％的比例，转入新配置的含有相应抗生素的YEP培养基中，在与上述相同的条件下培养6h左右，OD600为0.5左右。5000rpm离心十分钟收集菌沉淀，用50mlYEP液体培养基重悬沉淀。取野生型烟草无菌苗的幼嫩叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm²的小块，放入菌液中，浸泡10min(其间不断摇动菌液使其侵染充分)。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。将侵染后的烟草叶片接种在MS+KT(2.0ug/ml)+IAA(1.0ug/ml)固体培养基上，28℃暗培养三天。将黑暗中共培养2-4天的烟草叶片转移到MS+KT(2.0ug/ml)+IAA(1.0ug/ml)+Kan(100ug/ml)+Cef(200ug/ml)中，用封口膜封好培养皿，在光照为3000lux、28℃、16h/8h光暗条件下选择培养。约2-3周后，待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽并转移到MS+Kan(200ug/ml)+Cef(200ug/ml)上进行生根培养，获得完整植株。

提取转化烟草的总DNA，PCR检测CbDRH基因是否转入，对扩增出合适条带的植株进一步提取总RNA，获得cDNA，以cDNA为模板进一步进行PCR检测，鉴定转化成功的转基因植株。结果发现T2，T3，T6，T8，T13为转基因植株。

实施例3

转基因烟草的抗寒性检测

选取转基因植株TL3，作为抗寒性检测的对象(野生型作为对照)，将其置于-4℃处理12h，观察植株生长状态，并测定质膜离子渗漏率。结果发现，野生型在处理后明显萎蔫，而转基因植株尚保持较好的生活力(图1)，转基因植株的质膜渗漏明显小于野生型(图2)。表明转基因烟草的抗低温能力高于野生型。

Claims

1.一种高山离子芥冷诱导基因CbDRH，其核苷酸序列如序列表中序列1所示：

1)序列表中序列1的DNA序列；

ATGAGCTCCTATGATCGTAGATTTGCTGATCCGAATTCGTATCGCCAACGCTCTGGCGCCCCAGTTG

GTCCATCTCAGCCAATGGATCCTTCTGCTGCACCGTACAATCCACGATACGGTGGTGGTGGTGGAT

ATGGACCGTCTCCTGTAATGGCCGGTGATGGCTCCGGGTATAGTCGGTACCCAGCTTTCCAGCCAC

CTACTAGTGGTTTCTCCGTTGGTCGCGGCGGAGGAGGAGGAAGAGGCACATATGGTCAATACGGC

GGCGGAGGAGGCGGCGGCAGTGGTGGGAATTGGGGAGGACGTGGTGGTGGATCGAATAAAAGA

GAGCTAGATAATGTTTCGCTTCCGAAGCAGAATTTTGGGAATCTTGTCCATTTCGAGAAGAATTTC

TACGTGGAAAGCCCCGATGTGCAGGCGATGACAGAACAGGATGTTGCGATGTATAGAACCGGGAG

GGATATATCCGTTGAAGGTCGTGATGTTCCTAAGCCGATTAGGATGTTCCAAGATGCTAACTTCCCA

GALAATATTCTCGAAGCGATTGCTAAGTTGGGATTCACTGAGCCAACACCGATACAATCTCAGGGA

TGGCCAATGGCTTTGAAGGGTAGGGATCTGATTGGTATTGCTGAGACTGGCTCTGGTAAGACATTA

GCTTACTTGTTACCAGCGTTGGTCCACGTAAGCGCACAACCTCGATTGAGTCAAGATGATGGCCCC

ATTGTGTTAATATTAGCGCCCACTAGAGAATTAGCTGTTCAGATTCAAGAGGAATCAAGGAAATTC

GGTCTGCGATCTGGTGTTAGAAGCACTTGTATCTATGGTGGTGCTCCTAAAGGACCTCAGATTCGC

GATCTTAGAAGAGGTGTTGAGATTGTAATTGCTACACCTGGTCGTTTGATCGATATGTTGGAGTGT

CAACATACTAATTTGAGGAGAGTAACTTACCTCGTGTTAGATGAAGCTGACCGAATGTTAGACATG

GGATTTGAACCCCAAATTAGAAAGATTGTATCTCAGATCCGACCTGATAGACAGACGCTGCTTTGG

AGTGCAACATGGCCACGAGAGGTTGAATCTCTTGCCAGGCAGTTTCTACGAGATCCATATAAGGC

CATTATTGGATCAGCAGATCTAAAAGCTAACCAGTCTATTAATCAAGTAATCGAGATTGTACCAACG

CCAGAGAAATACGCCAGGCTTCTTGCACTGCTTAAACAGTTAATGGATGGGAGTAAAATCCTAATA

TTCGTGGAGACAAAGAGAGGGTGTGATCAAGTGACTAGACAATTGAGAATGGATGGATGGCCAG

CTCTAGCCATACACGGTGACAAGAACCAATCGGAAAGAGATCGAGTCTTGTCAGAATTTAAGAGC

GGAAGAAGCCCGATAATGACTGCCACTGATGTAGCAGCAAGGGGACTTGGTAGGACAACTGTAA

CACAATAG

2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

3)该基因的读码框为自5’端第1到第1452位碱基。

2.含有权利要求1所述基因的表达载体。

3.根据权利要求1所述的高山离子芥冷诱导基因CbDRH，其特征在于：所述与植物抗寒有关的基因CbDRH，具有序列表中序列1的DNA序列。

4.一种由序列表中序列1的DNA序列所述的核苷酸序列所编码的蛋白质，其氨基酸残基序列如序列表中序列2所示：

序列表中序列2所述氨基酸序列：

MSSYDRRFADPNSYRQRSGAPVGPSQPMDPSAAPYNPRYGGGGGYGPSPVMAGDGSGYSRYPAFQP

PTSGFSVGRGGGGGRGTYGQYGGGGGGGSGGNWGGRGGGSNKRELDNVSLPKQNFGNLVHFEKNF

YVESPDVQAMTEQDVAMYRTGRDISVEGRDVPKPIRMFQDANFPDNILEAIAKLGFTEPTPIQSQGWP

MALKGRDLIGIAETGSGKTLAYLLPALVHVSAQPRLSQDDGPIVLILAPTRELAVQIQEESRKFGLRSG

VRSTCIYGGAPKGPQIRDLRRGVEIVIATPGRLIDMLECQHTNLRRVTYLVLDEADRMLDMGFEPQIR

KIVSQIRPDRQTLLWSATWPREVESLARQFLRDPYKAIIGSADLKANQSINQVIEIVPTPEKYARLLALL

KQLMDGSKILIFVETKRGCDQVTRQLRMDGWPALAIHGDKNQSERDRVLSEFKSGRSPIMTATDVAA

RGLGRTTVTQ。

5.将含有权利要求1所述基因的表达载体PBI121-35S-CbDRH转化农杆菌LBA4404，利用叶盘法转化烟草获得转基因烟草。其在烟草抗寒育种中的应用。