CN101410521A - 植物木质素含量的调控 - Google Patents

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    • C12N15/8255—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving lignin biosynthesis

Abstract

包含下列各部分的DNA构建体可用于减少或调节植物中的木质素含量：对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段。在某些实施例中，DNA构建体包括4CL、C3H、CCR、C4H、Cald5H、SAD或CCoAOMT基因的至少一部分。维管优选型和组成型启动子可用于驱动所述构建体的表达。

Description

植物木质素含量的调控
相关申请案信息
本申请案主张优先于在2004年9月22日提出申请的美国申请案第10/946,650号和在2004年9月22日提出申请的美国申请案第10/946,644号的权利，这两个案件均以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及通过操控木质素生物合成途径来进行基因修饰的植物(尤其是树木)，且更具体而言，本发明涉及通过下调4CL、C3H、CCR、C4H、Cald5H、SAD或CCoAOMT来进行基因修饰的植物以实现改变木质素含量。
背景技术
木质素(一种复杂的酚类聚合物)是次生木质部细胞壁中的主要组份。一般而言，木质素占木头(wood)干重的25％，此使其成为地球上继纤维素之后第二丰富的有机化合物。尽管木质素有利于维持茎的强度和刚度并可保护微原纤维免受物理、化学和生物攻击，但其会妨碍将木头转化成纸的过程。为了释放用于造纸用的木纤维，必须自经过加工的木屑中去除大部分木质素。自木纤维中提取木质素是一个艰难且昂贵的过程，涉及有害的化学品并产生毒性废物。
因此，从业人员已经在寻找更成本有效且对环境更友好的减少木制品中木质素含量的方法。一个替代方案涉及对木质素生物合成途径进行基因修饰。例如，Chiang等人已经试图通过对植物的木质素单体生物合成途径进行基因修饰来减少植物中的木质素含量。参见WO 02/20717。所述方法涉及用来自苯基丙烷途径的多个基因转化植物、在木质素单体生物合成途径中纳入关键木质素控制位点，例如酶4-香豆酸酯-CoA连接酶(4CL)、松柏醛5-羟化酶(Cald5H)、S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依赖型5-羟基松柏醛、O-甲基转移酶(AldOMT)、松柏醇脱氢酶(CAD)和关键醇脱氢酶(sinewy alcoholdehydrogenase，SAD)。同时，人们已经试图通过将这些基因的拷贝单独地导入植物基因组中来减少木质素含量。参见(例如)WO 00/58489(Scald)；WO 99/24561(4CL)。从业人员还在反义策略中运用这些基因来调节木质素生物合成。参见(例如)WO99/24561。尽管这些方法中的某些方法已成功地下调了木质素合成，但木质素的下调可能会对植物表现型不利。Anterola等人，Phytochemistry，61：221-294(2002)。因此，需要用于调节木质素表达的改进方法。
一种在mRNA水平使基因表达沉默的最新方法已经作为先前技术的有效替代方案出现。RNA干扰现象(RNAi)是一个通过导入可导致基因以序列特异性方式沉默的双链RNA(dsRNA)来引发的转录后过程。继首先在线虫(C.elegans)中发现RNA干扰现象(Fire等人，Nature，391：806-811(1998)和美国专利第6,506,559号)之后，人们发现了许多其中导入dsRNA可诱导序列特异性沉默效应的生物体实例。例如，据报导，RNAi天然存在于各种生物体(如线虫、锥体虫、植物、真菌和动物)中。实际上，RNAi最有可能用于保护生物体免受病毒侵袭，调节转座子活性和消除异常转录产物。
对果蝇黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的研究表明RNAi为两步作用机制(Elbashir等人，Genes Dev.，15(2)：188-200(2001))。首先，借助称作切酶(Dicer)的酶将长的dsRNA切成21-23个核糖核苷酸(nt)片段，称为小干扰RNA(siRNAs)。然后，siRNA与核糖核酸酶复合体(对于RNA诱导的沉默复合体称为RISC)结合，此使这个复合体靶向互补mRNA。RISC随后切割与互补siRNA相对的靶向mRNA，此使得所述mRNA对其它RNA降解途径敏感。
RNAi可为控制木质素合成的先前方法提供替代方案。然而，在实现该可能性之前，必须研发可在木质素合成过程中引发RNAi过程的DNA构建体。
发明内容
在一个实施例中，提供用于调节木质素相关基因的表达的DNA构建体。在另一实施例中，提供调节植物中木质素表达的方法。另外，还产生包含用于调节木质素相关基因的表达的DNA构建体的重组植物。
在一个实施例中，DNA构建体包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列。在某些实施例中，木质素单体生物合成途径中的基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H、Cald5H、SAD或CCoAOMT组成的群组。
在另一实施例中，DNA构建体包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于4-香豆酸酯辅酶A连接酶(4CL)基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列。本发明还提供包括使用这些构建体来调节、抑制和/或减少植物中木质素的表达的方法。
在又一实施例中，一种抑制植物细胞中木质素表达的方法包括将沿5’至3’方向包括下列各部分的构建体整合于所述植物细胞的基因组中：启动子、对应于4CL基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；及使所述植物细胞生长。本发明还提供通过这些方法产生的植物和植物细胞，以及源自所述植物和植物细胞的纸和木制品。本发明还提供源自这些转基因植物的纸浆和纸浆制品。另一方面，本发明提供源自这些转基因植物的实木制品。木制品包括(例如)木料、木材和复合材料。
在再一实施例中，产生沿5’至3’方向包含下列各部分的植物细胞：启动子、对应于4CL基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段。以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子对于植物细胞基因组而言可以是内源的或外源的。在其它实施例中，产生其中所述第一段DNA片段对应于C3H、C4H、CCR或CCoAOMT基因的至少一部分的植物细胞。
在植物中，LIM蛋白质已显示可控制木质素生物合成途径中的许多对于研发木头十分重要的基因(Kawaoka A，Ebinuma H 2001 Transcriptional control of ligninbiosynthesis by tobacco LIM protein.Phytochemistry 57：1149-1157，Kawaoka等人，Plant J.22：289-301(2000))。因此，在再一实施例中，产生沿5’至3’方向包含下列各部分的植物细胞：启动子、对应于LIM基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段及与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段。
在另一实施例中，一种制造木头的方法包括将沿5′至3′方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中：启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述木头。
另一方面，一种制造木浆的方法包括将沿5′至3′方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中：启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述木浆。
在另一实施例中，一种造纸方法包括将沿5′至3′方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中：启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述纸。
另一方面，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列且木质素单体生物合成途径中的所述基因是4CL基因且其中所述DNA构建体选自由pARB1202、pARB675和pARB599组成的群组。
在另一实施例中，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿在反义方向生成所述DNA片段的转录本，其中所述DNA构建体为pARB1201、pARB598、pARB411和pARB412。
在另一实施例中，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿正义方向生成所述DNA片段的转录本，其中所述DNA构建体为pARB368。
在其它方面，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于CAld5H基因的至少一部分的DNA片段上的启动子，其中所述DNA构建体选自由pARB1203、pARB1205、pARB675、pARB661、pARB662和pARB374组成的群组。
在再一实施例中，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于SAD基因的至少一部分的DNA片段上的启动子，其中所述DNA构建体选自由pARB486、pARB487和pARB488组成的群组。
一方面，本发明提供抑制植物中木质素表达的方法，其包括将包含如下启动子的DNA构建体整合于所述植物的基因组中：所述启动子以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上以便沿反义方向生成所述DNA片段的转录本。另一方面，抑制植物中木质素表达的方法包括将包含如下启动子的DNA构建体整合于所述植物的基因组中：所述启动子以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上以便沿反义方向生成所述DNA片段的转录本。另外，或另一选择为，所述方法可采用包含如下启动子的DNA构建体：所述启动子以可操作方式连接到对应于CAld5H基因的至少一部分的DNA片段上。在其它方面，抑制植物中木质素表达的方法涉及包含如下启动子的DNA构建体：所述启动子以可操作方式连接到对应于SAD基因的至少一部分的DNA片段上。
本发明还提供通过这些方法产生的植物和植物细胞，以及源自所述植物和植物细胞的纸和木制品。本发明还提供源自这些转基因植物的纸浆和纸浆制品。另一方面，本发明提供源自这些转基因植物的实木制品。所述木制品包括(例如)木料、木材和复合材料。
参照下列详细说明可易知本发明的其它目的、特征和优点。详细说明和具体实例表示较佳实施例，但其仅出于说明目的，因此所属领域的技术人员自此详细说明可易知属于本发明精神和范围内的各种变化形式和修改形式。而且，所述实例阐明本发明的原理而不能够期望这些实例具体阐明对于那些熟悉先前技术的人而言明显有用的可应用本发明的所有实例。
附图说明
图1(A)(SEQ ID NO：5、6、7、8、15、9和64，分别按照出现顺序给出)及图1(B)(SEQ ID NO：16、17、10、11、12和13)提供用于制造某些本文所述DNA构建体的引物和组份。
图2(A)(SEQ ID NO：65、25和26分别按照出现顺序给出)及图2(B)(SEQ IDNO：34和33)提供用于本文所述DNA构建体的组份。
图3提供显示所得转基因桉树高度的条形图。
图4A提供显示所得转基因桉树高度的条形图，而图4B图示所述转基因树木的平均木质素含量。
图5提供松树4CL基因(SEQ ID NO：66)的核酸序列。
图6(A)(SEQ ID NO：18、19、20和21，分别按照出现顺序给出)及图6(B)(SEQID NO：22、23、24和48，分别按照出现顺序给出)可鉴别若干松树4CL片段的核酸序列。
图7提供本发明DNA构建体的总体设计。
图8提供用于调节松树中木质素的若干4CL DNA构建体的示意图。
图9提供用于调节松树中木质素的若干4CL DNA构建体的示意图。
图10以图形方式说明通过4CLRNAi构建体调节木质素水平。木质素数值是通过NMR测量的细胞壁材料中的木质素百分比。
图11是桉树4CL构建体pARB345的质粒图。
图12是桉树4CL构建体pARB339的质粒图。
图13是桉树4CL构建体pARB341的质粒图。
图14提供火炬松试样的质谱。2000c＝对照；1268b＝包含DNA构建体pARB585的转基因树。
图15A是使用质量范围为m/z 50-200的转基因火炬松试样所收集质谱的PC 1分值对PC 2分值的散点图。图15B是突出显示构建体pWVC41和对照的聚集状况的散点图。
图16A是突出显示构建体pWVK154、pWVC40和对照的聚集状况的散点图。图16B是突出显示构建体pWVK158、pWVC46和对照的聚集状况的散点图。
图17是来自图16A中所选构建体的火炬松试样的质谱。被赋予木质素峰值的热解片段在对照谱图的上方示出。
图18是经pWVK154转化的转基因火炬松种系和未经转化对照种系的13CCP/MAS谱图。所述谱图表明：转基因种系与对照种系相比，芳族碳和甲氧基碳相对于碳水化合物区域减少(～60-110ppm)。
图19是使用2种主要组份通过PLS模型完全交叉验证测定的PLS预计木质素数值和NMR测定木质素数值的散点图。
图20提供木质素构建体pARB1201和pARB1203的质粒图。
图21提供木质素构建体pARB675和pARB598的质粒图。
图22提供木质素构建体pARB661和pARB662的质粒图。
图23提供木质素构建体pARB599的质粒图。
图24提供木质素构建体pARB1205和pARB1202的质粒图。
图25提供木质素构建体pARB368和pARB486的质粒图。
图26提供木质素构建体pARB487和pARB488的质粒图。
图27提供木质素构建体pARB411和pARB412的质粒图。
图28提供木质素构建体pARB374的质粒图。
具体实施方式
在一个实施例中，DNA构建体可用于抑制靶向基因的表达。本文所述构建体和方法可用于各活体外或活体内细胞中。一般而言，所述构建体通过编码双链RNA(dsRNA)和引发RNA干扰(RNAi)来选择性地抑制靶基因。在一较佳实施例中，所述DNA构建体可用于减少植物中的木质素含量。
一方面，本发明提供一种用于调节植物的木质素含量的DNA构建体。在一个实施例中，一种DNA构建体包括以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于4-香豆酸酯辅酶A连接酶(4CL)基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列。因此，当转录时，所述DNA构建体产生包含下列各部分的RNA分子：对应于4CL基因的至少一部分的第一段RNA片段、间隔区RNA片段和与所述第一段RNA片段互补的第二段RNA片段。包含C3H、C4H、CCoAOMT、松柏醛5-羟化酶(也称作阿魏酸酯-5-羟化酶(F5H))和CCR的DNA片段的构建体可以类似的方式作业。
尽管不完全了解本发明的运作机制且发明者并不希望将其发明限制于任何特定理论，但人们认为所得RNA分子的第一段和第二段RNA片段可形成茎环。所述茎环的dsRNA可能会降解为长度约为21-23个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)。随后，siRNA与核糖核酸酶复合体(对于RNA诱导的沉默复合体称为RISC)结合，此使这个复合体靶向互补mRNA。RISC然后切割与互补siRNA相对的靶向mRNA，此使得所述mRNA对其它RNA降解途径敏感。
在另一实施例中，DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿反义方向生成所述DNA片段的转录本。在再一实施例中，DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿正义方向生成所述DNA片段的转录本。在其它实施例中，DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于CAW5H基因或SAD基因的至少一部分的DNA片段上的启动子。
定义
短语“靶基因”和“相关基因”在本文中可互换使用。如本文中所理解，靶基因用于指专用于调节或抑制的基因。靶向基因可包含或可不含调控元件，例如，转录因子结合位点或增强子。可选择用于抑制的基因包括那些编码结构蛋白(例如，细胞壁蛋白)或调控蛋白(例如，转录因子和受体)的基因以及其它功能基因。而且，该术语不仅欲包括多肽的编码区而且欲包括DNA中存在的内含子、调控元件、启动子和转录终止子。因此，“靶基因的至少一部分”意欲包括转录序列的至少一部分和/或启动子的至少一部分和/或相关基因终止子的至少一部分。
本文所述DNA构建体最基本地包括一个启动子、一或多个DNA片段和一个转录终止子。本文所用“DNA片段”意欲指包含至少若干个相邻碱基的脱氧核糖核酸分子。对应于靶基因的DNA片段的长度可为30个碱基对(bp)或更多，较佳为至少50bp且少于2000bp，且更佳为至少100bp且少于750bp。DNA片段可为单链或双链。本发明上下文中的DNA片段可包括基因或cDNA或其一部分，或者其可包括启动子或调控元件或其一部分。
术语“RNA片段”是指包含至少若干个相邻碱基的核糖核酸分子。RNA片段可为编码完整多肽的转录本(即，mRNA分子)或者其可为所述转录本的一部分。而且，RNA片段不需要编码多肽或其任何部分，只要所述片段符合本文所定义RNA片段的品质。例如，RNA片段可包括不编码肽的内含子、5′-UTR或3′-UTR。当包含启动子、调控元件或非基因序列的DNA片段受到转录时，也可产生RNA片段。
术语“间隔区”是指隔离2个DNA或RNA片段的一系列相邻核苷酸。在一个实例中，“间隔区DNA片段”编码隔离2个RNA片段的“间隔区RNA片段”。间隔区长度可在宽范围内变化，自10个碱基对(bp)至2000bp或更多。当非常长的DNA互补片段被短间隔区隔离时，构建体可能会不稳定。因此，间隔区较佳应为其所隔离片段长度的1/4至2倍。例如，如果存在长度为160bp的互补DNA片段，则二者之间的间隔区片段较佳可介于40至320bp之间。间隔区可编码自转录本切除的内含子，以使所得间隔区RNA远远短于转录本的互补DNA片段。
“互补”RNA或DNA片段是彼此可以特异性方式结合的片段。较佳地，2个互补片段的序列彼此之间应至少80％互补。更佳地，互补性应为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至是100％。彼此互补的DNA片段的长度可为30个碱基对(bp)或更长，较佳为至少50bp且少于2000bp且更佳为至少100bp且少于750bp。
例如，95％互补性意指互补RNA或DNA片段的核苷酸将以精确的碱基对碱基的方式彼此结合，只是一个RNA或DNA片段对于另一互补RNA或DNA片段链的100个碱基可能含有至多5个点突变。点突变可为删除碱基或取代碱基形式。而且，参考序列的这些突变可发生在一个互补核苷酸序列的5′或3′末端位置或两个末端位置之间分别散布于参考序列中各核苷酸中或参考序列中一或多个相邻基团中的任何地方。
事实上，可通过(例如)使用GAP计算机程序(6.0版，可自University of WisconsinDenetics Computer Group(UWGCG)获得)对比序列信息来确定互补性百分比以及一致性。所述GAP程序利用Needleman和Wunsch比对方法(1970)。简单来说，GAP程序将相似性定义为相似的被比对符号(即，核苷酸或氨基酸)数量除以两个序列中较短一个序列中的总符号数量。GAP程序的较佳缺省参数包括：(1)核苷酸的单元比较矩阵(含有表示一致性的数值1和表示不一致的数值0)，及Gribskov和Burgess加权比较矩阵(1986)，(2)对于每个空隙罚分为3.0且对于每个空隙中的每个符号额外罚分为0.10；和(3)对于末端空隙无罚分。或者，可使用Bestfit程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version 8 for Unix，Denetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，Wis.53711)评定互补性百分比。Bestfit使用Smith和Waterman局部同源算法(Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981))来搜寻两个序列间最佳同源片段。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序来测定一具体序列是否有(例如)95％等同于本发明的参考序列时，当然应将参数设定为能计算全长参考核苷酸序列的一致性百分比并允许在参考序列中含有占核苷酸总数量至多5％的同源空隙。
在对置DNA链上具有相似或相同序列的两个DNA片段被称作“反向重复序列”。通过具有反向DNA重复序列的区域转录可产生彼此“互补”的RNA片段。包含两个互补的RNA片段的转录本可形成具有双链区的单一RNA分子。所述双链区有时被称为“茎环”或“发夹结构”。
“转录终止子”意指编码可造成RNA聚合酶停止或延迟转录的RNA转录本3′-末端的DNA片段。由于大多数真核mRNA在其3′-末端添加有poly(A)片段，因此大多数转录终止子可确定添加有腺苷残基的一个或多个碱基。因此，转录终止子可包含编码mRNA的3′-UTR的至少一部分的DNA，所述mRNA紧邻且包括其中添加有poly(A)尾的核苷酸。转录终止子还可包括紧随聚腺苷酸化作用位点之后的DNA序列的至少一部分以便为转录停止位点提供更完整的DNA背景。转录终止子还包括可终止转录的片段，但不包括用于聚腺苷酸化作用的终止子，例如，组蛋白基因或核糖体RNA基因的转录终止子。
本文所用DNA构建体还包括载体。术语“载体”是指能够在宿主细胞内自动复制的DNA分子。如那些所属领域的人员所知，载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、病毒载体、噬菌体载体、酵母载体、哺乳动物载体和诸如此类。通常，载体会包含编码抗药性标记的基因，即胸苷激酶基因或补充营养缺陷体的基因。为了有助于选择含有这些载体的宿主细胞纯系，人们已将各种抗生素抗性基因并入载体中。例如，并入欲导入细菌宿主细胞的载体中的抗生素抗性基因包括但不限于对选自由下列组成群组的抗生素产生抗性的基因：氨苄西林(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、四环素、新霉素(neomycin)、G418、杀稻瘟菌素(blastocidin)S和氯霉素。用于补充营养缺陷体的基因是编码可促进宿主利用营养或功能组份(例如，嘌呤、嘧啶、氨基酸(例如，赖氨酸、色氨酸、组氨酸、白氨酸、半胱氨酸)或鞘脂)的酶或蛋白质的基因。
另外，载体还将包括用于特定宿主细胞的复制起点(复制子)。例如，各种原核复制子已为那些所属领域的人员所熟知且其可用于引导原核宿主细胞中重组分子的自动复制和维持。
术语“以可操作方式连接”是指DNA的化学融合、连接或合成以便在对于拟转录成RNA片段的DNA序列适当的方向上形成启动子-DNA序列组合。可通过启动子(可联合其它调控元件)调控启动子-DNA序列的转录。或者，可不通过启动子调控启动子-DNA片段的转录。在启动子-DNA序列组合的构造中，通常较佳的情形是使启动子位于距DNA片段的初始密码子上游一段距离处，所述距离和启动子与其在其自然背景中控制的片段之间的距离大致相同。然而，如此项技术所知，在不损失启动子功能的情况下，可允许所述距离有显著变化。
术语“启动子”指能够结合RNA聚合酶以引发转录的天然或合成核苷酸序列。这些启动子为那些所属领域的人员所熟知且其可包括细菌、病毒、真菌、植物、哺乳动物或其它真核生物启动子，这些启动子的选择取决于被转化的宿主细胞或生物体。人们预计，当所抑制构建体在与靶基因相同的组织中转录时，靶基因沉默将是最有效的。尽管有证据表明可将沉默信号移位至植物的远端部分(例如，Palauqui and Vaucheret，1998，PNAS 95：9675-9680.)，但是某些细胞可能不能够接受此信号。例如，病毒抑制构建体并不能使生长芽尖端的GFP表达沉默(Dalmay等人，2000，Plant Cell 12：369-379)。为了使在许多类别细胞中表达的基因沉默，较佳采用具有至少中等强度的组成型启动子。可在植物中起作用的组成型启动子的实例是病毒启动子，例如CaMV35S或FiMV(Sanger等人，1990.Plant Mol.Biol.14：433-443)；细菌启动子，例如胭脂氨酸合成酶(nos)或甘露氨酸合成酶(mas)；或植物启动子，例如那些来自芥菜属肌动蛋白2或遍在蛋白10基因者(An等人，1996，Plant J.10：107-121；Norris等人，1993，PlantMol.Biol.21：895-906)。使用组成型启动子来驱动抑制构建体还可使具有限制表达方式的靶基因沉默。然而，可能需要避免抑制构建体的表达超出沉默表现型所需要的程度。可使用与靶基因具有类似表达方式的抑制构建体启动子。例如，如果计划使表达木质部的靶基因沉默，则可使用荷兰芹4CL基因的启动子(Hauffe等人，1993，Plant J.4：235-253)，或如果靶向分生组织特异性基因，则可使用阿拉伯芥PROLIFERA启动子(Springer等人，1995，Science 268：877-880)。在一个实施例中，启动子源自不同于被转化物种的物种以避免相同启动子序列之间的相互作用。用于在真核细胞中表达的各种其它启动子已为此项技术所熟知，包括但不限于病毒或病毒样基本启动子，如SV40晚期启动子和RSV启动子；及真菌或哺乳动物细胞启动子(参见，例如Larsen等人，1995，Nucleic Acids Res.23：1223-1230；Donis等人，1993，BioTechniques 15：786-787；Donda等人，1993，Mol.Cell.Endocrinol.90：R23-26；和Huper等人，1992，In Vitro CellDev.Biol.28A：730-734)。可在真核细胞中用于引导重组分子在真核宿主细胞中复制和维持的各种复制子(其为重组分子的一部分)已为那些所属领域的人员所熟知。
术语“调控元件”是指可影响DNA转录或mRNA转译的特异性或效率的核酸序列，包括但不限于转录因子的结合位点、增强子、和转录或转译引发和终止信号。增强子序列是指与附近DNA片段相比，以相对独立于其位置和方向的方式呈现增加转录效率的DNA元件。因此，视DNA构建体而定，增强子可位于特定DNA片段的上游或下游以增加转录效率。可使用此项技术中已知的重组DNA方法将这些调控元件插入构建体DNA序列中。其它调控元件包括但不限于RNA片段上的5′未转译区(5′UTR)以及RNA片段上的3′UTR(即，包括poly(A)尾)，其对于达成稳定性及有效转译RNA片段或转录本而言是必需的。
本文所用“盒”是一类包含启动子、转录终止子和插入这二者之间的DNA片段的DNA构建体。盒可用于在其中启动子处于激活状态的宿主细胞或生物体中驱动DNA或RNA片段的表达。
术语“实质序列一致性”描述两个或更多个核苷酸序列的相关性。较佳地，所述序列彼此之间至少80％是相同的，如上文所计算。更佳地，所述一致性应为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％。
“约”将为所属领域的普通技术人员所了解且在使用此词语的上下文中具有一定程度的不同。如果使用此词语的上下文中所使用的此词语不为所属领域的普通技术人员所了解，则“约”将意指特定词语的至多±10％。
讨论
本发明一方面提供用于调节植物中木质素含量的DNA构建体。在一个实施例中，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于4-香豆酸酯辅酶A连接酶(4CL)基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列。
组成型启动子，例如来自辐射松(P.radiata)的超级泛素(superubiquitin)(美国专利第6,380,459号，其以引用的方式并入本文中)，可用于驱动靶基因4CL或其它木质素生物合成基因的表达。在另一实施例中，本发明的DNA构建体包含特异性地引导木质部表达的启动子。自火炬松(P.taeda)的4CL基因上游区分离的启动子片段(美国专利第6,252,135号，其以引用的方式并入本文中)是一个显示强木质部优选型表达的启动子的实例。本文所述实验证据表明在本发明DNA构建体中使用4CL启动子可有效地减少木质素含量而不会对植物高度造成不利影响。
本发明构建体的第一段和第二段DNA片段可源自任何4CL基因。在一较佳实施例中，当改变松树或桉树中的木质素含量时，所述第一段和第二段DNA片段源自辐射松(松树)的4CL基因(美国专利申请公开案第20030131373号)或巨桉(E.grandis)的4CL基因(美国专利第6,410,718号)。同样地，本发明构建体的第一段和第二段DNA片段可源自4CL基因的任何部分。例如，可使用约50bp、100bp、200bp、400bp、600bp或1000bp的片段。本文所示其它示范性长度包括189bp、327bp、334bp、373bp、389bp和668bp。在较佳实施例中，第一段DNA片段包括选自图示于图SEQID NO 18、19、20、21、22、23、24、33和48中的序列的片段。
第一段DNA片段可源自4CL基因的正义链或反义链。由于第二段DNA片段与第一段DNA片段互补且因此源自反向链，因此第一段DNA片段的链选择必然会影响第二段DNA片段的来源。
如上文所述，间隔区DNA片段编码用于隔离其它RNA片段的间隔区RNA片段。间隔区RNA片段在本发明中可充当由本发明构建体的DNA盒转录形成的茎环中的环。间隔区DNA片段可以是完全合成的或源自天然DNA序列。在一个实施例中，间隔区DNA片段是源自内含子。示范性间隔区DNA片段如图1所示。
可使用此项技术中熟知的设计用于操控核酸分子的方法和技术来分离先前鉴别的相关基因或其部分或启动子。例如，用于分离、纯化和克隆核酸分子的方法以及阐述使用真核和原核宿主细胞及在其中表达核酸和蛋白质的方法和技术由Sambrook等人阐述于Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)和Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.Ausubel等人编写，JohnWiley & Sons，Inc.，1987)中，其揭示内容以引用的方式并入本文中。
可将包含相关基因或启动子的至少一部分的DNA构建体导入宿主细胞中，如上文所述，所述宿主细胞可为个体细胞、培养中细胞、作为宿主生物体一部分的细胞、受精卵母细胞或配子体或胚细胞。术语“导入”是指此项技术中已知的用于将重组载体DNA传递到靶宿主细胞中的标准程序。这些程序包括(但不限于)转染、感染、转化、自然吸收、电穿孔、基因枪法和土壤杆菌法。土壤杆菌法已经被成功地用于各种物种，包括杨树(Leple，J.C.等人，1992.Plant Cell Rep.11：137-141.)、桉树(Tournier，V.等人，2003.Transgenic Res.12：403-411)和松树(美国专利第6,518,485号(基因枪)和美国公开专利申请案第20020100083号)。土壤杆菌法是用于成功地获得转基因火炬松、挪威云杉(Wenck，A.R.等人，1999.Plant Mol.Biol.39：407-416.)、水稻(Hiei，Y.等人，1997.Plant Mol.Biol.35：205-218.；Cheng，X.等人，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95：2767-2772.)、小麦(Cheng，M.等人，1997.Plant Physiol.115：971-980.)和玉米(Ishida，Y.等人，1996.Nat Biotechnol.14：745-750.)的再生植物的唯一公开方法。转化法已经被用于诸如大麦(Tingay，S.等人，1997.Plant J.11：1369-1376.)、甘蔗(Arencibia，A.D.等人，1998.Transgenic Research 7：1-10；Enriquez-Obregon，G.A.等人，1998.Plant 206：20-27.)、香蕉(May，G.D.等人，1995.Bio/Technology 13：486-492.)、石刁柏(Asparagus officinalis)(Delbreil，B.等人，1993.Plant Cell Rep.12：129-132.)和早花百子莲(Agapanthus praecox)(Suzuki，S.等人，2001.Plant Sci.161：89-97.)等种系。
可以各种方式测量DNA构建体在调节木质素含量方面的效能。例如，可按照USDairy Forage Research Center(Madison，Wisconsin)所用程序对不含提取物的磨碎试样进行乙酰溴木质素测定(Fukushima，R.S.和Hatfield，R.D.，J.Ag.Food Chem.，49(7)：3133(2001))。还可使用热解分子束质谱。所述方法包括在惰性氦气氛中于500℃下迅速加热试样(0.1g)。通过扩展经过一取样孔继而形成分子束直接对所生成的热解产物实时取样，此可提供快速试样骤冷并可抑制试样冷凝。所述质谱仪提供所有取样产物的通用检测且分子束取样可确保对来自初始分子的代表性产物进行检测(Magrini等人，Environmental Pollution，116：255-268(2002))。在另一实例中，可使用核磁共振法(NMR)来分析木质素结构。NMR是一种通过测量核在磁场影响下所吸收的射频电磁辐射来检测分子的亚原子和结构信息的分析方法。通常，1H和13C是采用Li，S.和K.Lundquist方法(Nordic Pulp and Paper Research J.，3.191-195)来定性未衍生化木质素的两种主要核。
木质素水平的降低和可能伴随的树木CHO水平的增加对于纸浆工业可为经济的且环保的优势。减少枝条中的木质素可减少制浆所需化学品且甚至可能减少漂白纸浆所需化学品的量。
下列实例用于阐明本发明的各个实施例且不应以任何方式将其诠释为限制本发明的范围。
实例
实例1.cDNA文库的构造
为了鉴别辐射松和巨桉数据库中的木质素单体合成、木质素单体运输和木质素聚合候选基因，可对cDNA序列与公共结构域序列进行比较(通过SWISS-PROT/TrEMBLID)以针对松树和桉树数据库进行搜寻(通过重叠群(contig)确定无冗余，预计值＜1.0e-2)。
随后获得用于这些匹配物的重叠群一致DNA和蛋白质序列并鉴别重复序列。然后使用蛋白质序列进行多序列比对。使用其余松树和桉树序列以及阿拉伯芥成员可产生蛋白质比对。自该蛋白质比对产生树状图。通过引物步移法分析这些序列以提供一全长序列(最佳HT取自全长序列经分析的重叠群)。
还提取来自玉米、棉花、水稻和杨树的公共结构域木质素单体合成、木质素单体运输和木质素聚合基因序列并与松树和桉树数据库对比。完整引物步移的松树和桉树序列也与自身序列对比并取前500个匹配物。实施此举以便可使用所述序列进一步搜寻并通过使用阿拉伯芥超家族确保未遗漏松树和桉树数据库中的任何数据。此搜寻找到在先前搜寻中未发现的另外4个序列。然后也将这些序列发送到经引物步移的全长序列。
在引物步移后去除少量的额外重复体之后，鉴别松树和桉树的引物步移木质素单体合成、木质素单体运输和木质素聚合超家族成员。通过与ClustalX、对应树状图和MEME/MAST分析比对来确定这些序列的分类。
为了鉴别cDNA文库中部分cDNA序列5′或3′的额外序列，使用SMART RACEcDNA扩增套组(Clontech Laboratories，Palo Alto，Calif)对cDNA末端(RACE)进行5′和3′快速扩增。一般来说，所述方法具体包括如下步骤：首先分离poly(A)mRNA，进行第一链和第二链cDNA合成以生成双链cDNA、钝化cDNA末端且随后将SMARTRACE衔接子连接至cDNA以形成经衔接子连接的ds cDNA文库。基因特异性引物被设计为与衔接子特异性引物一起用于5′和3′RACE反应。使用5’和3’RACE反应，可获得、排序和克隆5’和3’RACE片段。可重复此过程直至鉴别出全长基因的5’和3’末端。通过PCR使用对基因的5’和3’末端具有特异性的引物(通过末端对末端PCR)可产生全长cDNA。
例如，为了扩增第一链cDNA的基因的缺失5′区，自模板序列的反向链将引物从5′设计为3’且其来自模板序列的介于～100-200bp之间的区域。成功的扩增应在模板的5′末端与PCR产物之间得到～100bp的DNA序列重叠区。
使用Concert Reagent Protocol(Invitrogen，Carlsbad，CA)及标准分离和提取程序自4种松树组织(即，籽苗、木质部、韧皮部和结构根部)提取RNA。然后用Dnase、使用10U/微升DNase I(Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)处理所得RNA。对于100μgRNA，使用9μl 10x DNase缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、10μl Roche DNase I和90μl不含Rnase的水。然后在室温下将RNA培育15分钟并加入1/10体积的25mMEDTA。使用RNeasy微型套组(Qiagen，Venlo，The Netherlands)按照制造商的方案进行RNA纯化。
为了合成cDNA，使用自木质部、韧皮部、籽苗和根部提取的RNA且随后按照制造商的方案使用SMART RACE cDNA扩增套组(Clontech Laboratories Inc，Palo Alto，CA)。对于RACE PCR，组合来自4种组织的cDNA。通过混合等体积的来自木质部、韧皮部、根部和籽苗组织的cDNA来形成用于PCR的主混合物。在96孔PCR平板中进行PCR反应，并将1ml引物从引物稀释平板(10mM)移至对应的孔位置。将49ml主混合物等份加至具有引物的PCR平板中。使用Dene Amp 9700(Applied Biosystems，Foster City，CA)以下列参数开始热循环：
94℃(5sec)，
72℃(3min)，5个循环；
94℃(5sec)，
70℃(10sec)，
72℃(3min)，5个循环；
94℃(5sec)，
68℃(10sec)，
72℃(3min)，25个循环。
按照标准程序使用琼脂糖凝胶分离cDNA。通过按照制造商说明书使用Qiagen 96-孔凝胶稀释套组切除凝胶片段并自所述凝胶洗提凝胶片段。
按照下列说明将PCR产物连接到96孔板中的pGEMTeasy(Promega，Madison，WI)过夜：用水将60-80ng DNA、5μl 2X快速连接缓冲液、0.5μlpGEMT easy载体、0.1μlDNA连接酶补足至10μl并培育过夜。
按照标准程序将每个纯系转化到大肠杆菌(E.coli)中并从按照标准方案选取的12个纯系提取DNA。使用1％琼脂糖凝胶来验证DNA提取和DNA品质。通过限制酶消化、使用限制性内切酶EcoRI和凝胶电泳并按照标准实验室程序测定各个纯系中适当尺寸插入体的存在。
实例2.松树4CL表达载体的构造
制备一系列包含来自火炬松4CL基因的至少一部分的重组构建体并评定其减少植物中木质素含量的能力。一般而言，每一DNA构建体均包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于4CL基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列。设计11种构建体并使用辐射松4CL基因的不同片段(图5)和不同启动子制备这些构建体。构建体的一般设计图示于图7至9中。使用超级泛素启动子(美国专利第6,380,459号，Ranjan J Perera等人，Plant & Animal Genome VIII Conference(2000))作为组成型启动子，而使用来自火炬松的4CL启动子(美国专利第6,252,135号)作为维管优选型启动子。使用源自拟南芥YABBY基因(SEQ ID NO：64)的内含子(Foster TM等人，Plant Cell，14(7)：1497-1508(2002))作为间隔区DNA片段。构建体利用图示于图5中的来自辐射松的4CL基因部分。图6A-6B提供所述构建体中所用的4CL RNAi片段的核酸序列(A至H)(SEQ ID NO：18-24和48)。
通过向质粒pBluescript(BRL Gibco Life Technologies，Gaithersburg MD)的多克隆位点添加额外的限制性内切酶位点来制备骨架载体。通过消化具有NotI和SstI的质粒及使用Klenow和T4聚合酶(Invitrogen公司，Carlsbad CA)填充末端来破坏初始pBluescript载体中的NotI和SstI位点。通过平端连接来环化质粒并随后用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化以促进连接子克隆。将含有额外限制酶切位点的连接子(在5′末端受到磷酸化)(在SEQ ID NO：1和2中给出)一起退火并连接到经EcoRI/HindIII消化的pBluescript载体中。
将来自辐射松超级泛素基因(美国专利第6,380,459号)的3′UTR克隆到质粒pBI-121中(Jefferson等人，EMBO J.6：3901-3907，1987)。首先，使用标准PCR技术及SEQ ID NO：3和4中给出的引物来扩增所述基因的3′UTR片段。这些引物含有额外的核苷酸以提供SstI限制酶切位点以供用于克隆到经SstI消化的质粒pBI-121中。然后，将含有nos终止子的3′UTR片段转移至pBluescript质粒中。借助PCR使用SEQ IDNO：5和6中给出的引物扩增pBI-121的3′UTR和nos终止子片段，用KpnI和ClaI切除并克隆到经KpnI和ClaI消化的经修饰pBluescript中。
向此构造物中添加具有内含子的辐射松超级泛素启动子序列。首先，使用标准PCR技术及SEQ ID NO：7和8的引物自美国专利第6,380,459号中鉴别的辐射松超级泛素序列扩增启动子/内含子序列。然后使用XbaI和PstI限制酶消化将经扩增片段连接到基础载体中。
使用标准PCR技术及SEQ ID NO：10和11的引物扩增来自辐射松cDNA的辐射松4CL内含子序列(SEQ ID NO：9)，然后使用T-尾连接克隆到经XcmI消化的载体骨架中。
为了自巨尾桉和辐射松分离和定性木质素单体合成、木质素单体运输和木质素聚合样基因，自植物组织提取总RNA(使用Chang等人的方案，Plant Mol.Biol.Rep.11：113-116(1993))。自韧皮部(P)、形成层(C)、扩展木质部(XI)、及分化和木质化木质部(X2)获得植物组织试样。
使用Poly(A)Quik mRNA分离套组(Stratagene，La Jolla，CA)或Dynal Beads Oligo(dT)25(Dynal，Skogen，Norway)自总RNA制备物分离mRNA。通过逆转录酶合成、然后按照制造商的方案使用ZAP Express cDNA合成套组(Stratagene)将所得cDNA纯系插入Lambda ZAP中来从经纯化mRNA构造cDNA表达文库。使用Gigapack IIPackaging Extract(Stratagene)用来自5mL连接反应物的等份试样(1-5μL，取决于所述文库)封装所得cDNA。使用具有ExAssist辅助噬菌体(Stratagene)的XLOLR细胞(Stratagene)和XL 1-Blue MRP′细胞来实施所述文库的大块切除。切除的噬菌粒用NZY肉汤(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)稀释并铺在含有X-gal和异丙基硫基-β-半乳糖苷(IPTG)的LB-卡那霉素琼脂平板上。
在平铺及选择用于DNA微量制备物的菌落中，99％含有适用于测序的插入体。在具有卡那霉素的NZY肉汤中培养阳性菌落并借助碱裂解方法和聚乙二醇(PEG)沉淀方法纯化cDNA。使用1％琼脂糖凝胶来筛选用于染色体污染的测序模板。使用TurboCatalyst 800机器(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division，Foster City，CA)按照制造商的方案来制备染色引物序列。
使用Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Prism 377序列分析仪获得阳性纯系DNA序列。首先自5′末端且在某些情况下也可自3′末端对cDNA纯系测序。对于某些纯系，使用外切核酸酶III删除分析(在pBK-CMV中产生一不同尺寸的亚纯系文库)或通过使用设计为相关基因鉴别区的基因特异性引物直接测序可获得内部序列。
使用实例1中所述方法，自木质部构造辐射松cDNA表达文库并进行筛选。在Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Prism 377序列分析仪上使用正向和反向引物获得阳性纯系DNA序列并将所测定序列与上述EMBL数据库中的已知序列对比。根据与其它植物物种已知序列的相似性，将所分离DNA序列鉴别为编码4CL(SEQ ID NO：18-24和48)和咖啡酰基CoA甲基转移酶(SEQ ID NO：44)。使用标准PCR技术和引物SEQ ID NO：12和13扩增来自辐射松4CL cDNA纯系的片段。对所述引物进行设计以向扩增片段的两个末端添加Pstl和Clal限制酶切位点。扩增片段的核苷酸序列作为SEQ ID NO：24提供。沿正义方向克隆辐射松4CL片段时，需使用限制酶PstI切割扩增片段、使用Klenow平端化并将其克隆到位于平端化ClaI位点的骨架载体中。沿反义方向克隆辐射松4CL片段时，需使用PstI消化扩增片段并将其克隆到经PstI消化的骨架载体中。
使用设计类似于上文那些用于Pr4CL和PDK内含子序列者的引物扩增yabby内含子序列(Foster等人，2002，Plant Cell.14(7)：1497-1508)并将其克隆到上文所述的载体骨架中。使用设计类似于那些用于SEQ ID NO：24者的引物扩增6个额外的片段(SEQ ID NO：18-23)，不同之处为将SEQ ID NO：18的引物设计为向扩增片段的两个末端添加SmaI限制酶切位点；将SEQ ID NO：19的引物设计为在扩增片段的两个末端添加EcoRI和HindIII限制酶切位点；将SEQ ID NO：22的引物设计为在扩增片段的两个末端添加PstI限制酶切位点。将SEQ ID NO：23的引物设计为向扩增片段的一个末端添加SmaI限制酶切位点而向该扩增片段的另一个末端添加EcoRI和HindIII限制酶切位点。按照上文所述或通过使用所列举限制酶沿正义和反义方向将所有7个片段克隆到骨架载体中。将含有启动子::正义片段::内含子::反义片段::3′UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒自如上文所述pBluescript质粒移除并使用标准克隆技术将其克隆到双元载体pART27或pART29(经NotI消化)中。.双元载体pART29是经修饰pART27载体(Gleave，Plant Mol.Biol.20：1203-1207，1992)，其含有阿拉伯芥遍在蛋白3(UBQ3)启动子而非nos 5′启动子且无lacZ序列。
通过NotI限制酶消化将含有启动子::正义片段::内含子::反义片段::3′UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒(SEQ ID NO：14)自pBluescript质粒移除并使用标准克隆技术将其克隆到双元载体pART29(经NotI消化)中以产生最终载体pARB513。
通过下列来重新改造构建体以供用于松树：移除NotI片段并将这些片段插入具有NotI位点以及组成型启动子表达GUS(以验证不使用PCR时的转化)和可选标记盒(其包含受阿拉伯芥Ubq10启动子驱动的nptII)的基础载体中。使用限制酶NotI自表1“被改造者”列中所列各载体移除启动子::4CL RNAi盒。使用限制酶NotI来线性化载体pWVR31并用SAP处理以防止其重退火到其原本状态。将每一片段连接到NotI位点处的pWVR31以生成表1中所列载体。
表1.
  再改造构建体编号   被改造者
  pWVC60   pARB318
  pWVC62   pARB319
  pWVK158   pARB320
  pWVK154   pARB321
  pWVK157   pARB322
  pWVK155   pARB323
  pWVK143   PARB332
  pWVC42   pARB333
  pWVC46   pARB334
  pWVC40   pARB335
  pWVC43   pARB336
  pWVC44   pARB337
  pWVC45   pARB338
构建体pWVK154、pWVK143、pWVC46和pWVC40由美国典型培养物保藏中心(P.O.Box 1549，Manassas，Virginia，USA，20108)在2004年9月21日保存且分别给予ATCC登录号PTA-6229、PTA-6228、PTA-6227和PTA-6226。
通过分别将来自火炬松的4CL启动子(美国专利第6,252,135号)和来自辐射松的超级泛素基因(美国专利第6,380,459号)以及GUS(内含子)基因(参考)克隆到载体pWVR31中来生成对照载体pWVC41和pWVK159。骨架载体pWVR5是其中35S启动子GUS序列被移除且NOS启动子被来自阿拉伯芥的UBQ10启动子(Sun，C.W &Callis，J(1997)Plant J.，11：101-111)代替的pBI121载体(Clontech laboratories，Palo AltoCA)。为了制备载体pWVR8，需扩增肌动蛋白II启动子(MEAGHER，Int.Rev.Cytol，125：139-163(1991))并将其与GUS+内含子基因一起克隆到pWVR5载体中(Ohta等人，Plant Cell Physiol，31：805-813(1990))。
自载体pWVR8(阿拉伯芥肌动蛋白II::GUSINT，UBQ10::NPTII)改造骨架载体pWVR31。通过PCR使用引物扩增来自阿拉伯芥的UBQ11启动子(Norris SR等人，(1993)Plant Mol Biol.21(5)：895-906)且用此代替来自pWVR8的肌动蛋白II启动子以制备载体pWVR31。
另外，还可按照上文所述构造表2中所列举载体，但下列序列的至少一个会受到修饰：启动子和/或双元载体。为了将表2中所列举的不同启动子克隆到最终载体中，需用SmaI和SstI限制酶和使用标准技术消化辐射松超级泛素启动子内含子载体，使用标准技术将此片段克隆至含有下列各部分的Bluescript载体中：来自火炬松的4CL启动子、来自巨桉的COMT启动子或来自辐射松的LIM启动子。火炬松4CL启动子(美国专利第6,252,135号)、巨桉COMT启动子(美国专利第10/703,091号)和辐射松LIM启动子(美国专利申请案第10/717,897号)全部使用设计类似于那些用于扩增具有上述内含子的辐射松超级泛素启动子序列者的引物来扩增且随后将其连接到上述Bluescript基础载体中。通过NotI限制酶消化自pBluescript质粒移除含有启动子::正义片段::内含子::反义片段::3′UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒并使用标准克隆技术将其克隆至双元载体pART29或pWVK147(经NotI消化)中。pWVK147载体是其中35S启动子GUS序列被移除且NOS启动子被来自阿拉伯芥的UBQ10启动子代替(Sun，C.W & Callis，J(1997)Plant J.，11：101-111)以驱动nptII基因的pBI121载体(Clontechlaboratories，Palo Alto CA)。通过添加连接于ApaI和KpnI位点的衔接子可向载体添加独特的HpaI限制酶切位点。
表2
最终载体   其中插入最终盒的基础双元载体  驱动含有辐射松4CL内含子作为间隔区的4CL RNAi盒的启动子 片段
  pARB553   pWVK147   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)  4CL片段G.(SEQ ID NO：24)
  pARB555   pWVK147   火炬松4CL(SEQ ID NO：77)  4CL片段G.(SEQ ID NO：24)
  pARB561   pWVK147   巨桉COMT 485 bp片段(SEQ ID NO：78)  4CL片段G.(SEQ ID NO：24)
  pARB562   pWVK147   辐射松LIM1607bp片段(SEQ ID NO：79)  4CL片段G.(SEQ ID NO：24)
  pARB515   pART29   火炬松4CL(SEQ ID NO：77)  4CL片段G.(SEQ ID NO：24)
  pARB534   pART29   辐射松LIM1607bp片段(SEQ ID NO：79)  4CL片段G.(SEQ ID NO：24)
使用与那些上文所述者相同的方法构造表3中所列举载体，不同之处为使用标准PCR技术并使用引物SEQ ID NO：16和17来扩增PDK内含子序列(Wesley等人，PlantJ.27：581-590，2001)(SEQ ID NO：15)。对于每个构建体，表达盒中的表达基因均是4CL片段G(SEQ ID NO：24)。
表3.
最终载体   其中插入最终盒的基础双元载体   驱动含有PDK内含子作为间隔区的4CL RNAi盒的启动子
  pARB554   pWVK147   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)
  pARB556   pWVK147   火炬松4CL(SEQ ID NO：77)
  pARB557   pWVK147   巨桉COMT 485bp片段(SEQ ID NO：78)
  pARB558   pWVK147   辐射松LIM 1607bp片段(SEQ ID NO：79)
  pARB514   pART29   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)
  pARB516   pART29   火炬松4CL(SEQ ID NO：77)
  pARB518   pART29   辐射松LIM 1607bp片段(SEQ ID NO：79)
实例3.桉树4CL表达载体的构造
按照上文所述制备一系列含有4CL基因的至少一部分的重组构建体并评定其减少植物中木质素含量的能力。一般而言，每一DNA构建体包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于来自巨桉的4CL基因的至少一部分(美国专利第6,410,718号)；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列。首先使用不同片段长度的4CL基因和不同的启动子制备3种构建体。参见表16。所述构建体的一般设计图示于图7中。超级泛素启动子(美国专利第6,380,459号；Ranjan J Perera等人，Plant & Animal Genome VIIIConference(2000))用作组成型启动子，而来自火炬松SEQ ID NO：77中4CL基因的启动子用作维管优选型启动子。来自阿拉伯芥(Foster TM等人，Plant Cell，14(7)：1497-1508(Plant Cell))YABBY基因的内含子用作间隔区DNA片段。图2A和2B提供4CL RNAi 200bp片段(SEQ ID NO：33)和4CL RNAi 600bp片段(SEQ ID NO：34)的核酸序列。
骨架载体的构造如实例2中所述。使用标准PCR技术和SEQ ID NO：25和26中给出的引物扩增来自巨桉4CL cDNA纯系(美国专利第6,410,718号)的片段。对引物进行设计以向扩增片段的两个末端添加PstI及ClaI限制酶切位点。扩增片段的核苷酸序列在SEQ ID NO：27中给出。为了沿正义方向克隆4CL片段，需用限制酶PstI切割扩增片段并将其克隆到骨架载体中。为了沿反义方向克隆4CL片段，需用ClaI消化扩增片段并将其克隆到骨架载体中。
通过NotI限制酶消化自pBluescript质粒移除含有启动子::正义片段::内含子::反义片段::3′UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒(SEQ ID NO：32)并将其克隆至如实例2所述的双元载体pART29(经NotI消化)中以产生最终载体pAB583。
通过使用设计类似于那些以上实例的片段中所用者的引物扩增另外4个片段(SeqID NO：28-31)来构造表4中所列举的最终载体。将所有5个片段沿正义和反义方向克隆到如上所述的骨架载体中，然后将完整RNAi盒克隆到如上所述的pART29中。
表4
最终载体 启动子   沿正向和反向克隆的RNAi片段   用作间隔区的内含子
pARB584   超级泛素(SEQ ID NO：76)   Euc.4CL 223bp(SEQ ID NO：28) SEQ ID NO：9
pARB585   超级泛素(SEQ ID NO：76)   Euc.4CL 300bp(SEQ ID NO：29) SEQ ID NO：9
pARB586   超级泛素(SEQ ID NO：76)   Euc.4CL 336bp(SEQ ID NO：30) SEQ ID NO：9
pARB587   超级泛素(SEQ ED NO：76)   Euc.4CL 500bp(SEQ ID NO：31) SEQ ID NO：9
使用与那些上文所述者相同的方法构造表5中所列举的载体，不同之处为使用标准PCR技术用引物SEQ ID NO：16和17来扩增PDK内含子序列(Wesley等人，PlantJ.27：581-590，2001)(SEQ ID NO：15)。
表5
最终载体 启动子   沿正向和反向克隆的RNAi片段   用作间隔区的内含子
  pARB578   超级泛素(SEQ ID NO：76)   Euc.4CL 200bp(SEQ ED NO：27)   SEQ ID NO：15
  pARB579   超级泛素(SEQ ID NO：76)   Euc.4CL 223bp(SEQ ID NO：28)   SEQ ID NO：15
  pARB580   超级泛素(SEQ ID NO：76)   Euc.4CL 300bp(SEQ ID NO：29)   SEQ ID NO：15
  pARB581   超级泛素(SEQ ED NO：76)   Euc.4CL 336bp(SEQ ED NO：30)   SEQ ID NO：15
  pARB582   超级泛素(SEQ ID NO：76)   Euc.4CL 500bp(SEQ ID NO：31)   SEQ ED NO：15
按照实例2中所述构造表6中所列举载体，其中有下列变化。使用设计类似于那些用于Pr4CL和PDK内含子序列者的引物来扩增yabby内含子序列(Foster等人，2002，Plant Cell.14(7)：1497-1508)并将其克隆到如实例2所述的载体骨架中。使用设计类似于那些以上实例中片段SEQ ID NO：27-31所用者的引物来扩增片段插入体SEQ EDN0：33和34。在下表6中指定处按照实例2中所述用火炬松4CL启动子替代来自辐射松超级泛素启动子+内含子的启动子。将所列举片段插入体和启动子克隆到如以上实例2中所述的最终载体中，然后将完整RNAi盒克隆到pART27中。yabby内含子(SEQ IDNO：64)在每一构建体中均用作间隔区。
表6
最终载体 驱动RNAi盒的启动子  在yabby内含子间隔区周围沿正向和反向克隆的RNAi片段
pARB339   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)   Euc.4CL200(SEQ ID NO：33)
pARB341   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)   Euc.4CL 600(SEQ ID NO：34)
pARB345 火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   Euc.4CL 200(SEQ ID NO：33)
pARB347 火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   Euc.4CL 600(SEQ ID NO：34)
通过NotI限制酶消化自上文所列举pARB345(SEQ ID NO：89)最终载体移除包含启动子::正义片段::内含子::反义片段::3′UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒及使用标准克隆技术将其克隆至双元载体pARB1002或pARB1005(经NotI消化)中来构造表7中所列举的最终载体。
表7
  最终载体   其中插入RNAi盒的基础双元载体
  pARB599   pARB 1002(SEQ ID NO：61)
  pARB639   pARB 1005(SEQ ID NO：63)
类似地，通过自pARB599删除开花基因来产生载体pARB1202。这样，pARB1202就包括含有下列各部分的RNAi盒：火炬松4CL启动子(SEQ ID NO：77)、正义Euc.4CL200bp片段(SEQ ID NO：33)、yabby内含子(SEQ ID NO：64)和反义Euc.4CL 200bp片段(SEQ ID NO：33)。pARB1202的示意图提供于图24中。
为了调节桉树植物中木质素含量，可使用包含启动子、第一段DNA片段和内含子的各种组合的构建体。利用从备选构建体中选择的构建体，从业人员可获得具有期望数量的木质素含量和生长的植物。在此方面，美国专利公开案第20040146904号和第20040163146号揭示多种维管优选型启动子且这些案件的全文均以引用的方式并入本文中。表8提供了可用于此方面的各种构建体。
表8
  启动子   片段   内含子
  巨桉COMT 485bp(SEQ ID NO：78)   Euc 4CL 200bp片段(1-200)(SEQ ID NO：27)   PDK(SEQ ID NO：15)
  巨桉COMT 485bp(SEQ ID NO：78)   Euc 4CL 223bp片段(201-423)(SEQ ID NO：28)   PDK(SEQ ID NO：15)
  巨桉COMT 485bp(SEQ ID NO：78)   Euc 4CL 300bp片段(551-850)(SEQ ID NO：29)   PDK(SEQ ID NO：15)
  巨桉COMT 485bp(SEQ ID NO：78)   Euc 4CL 336bp片段(1031-1378)(SEQ ID NO：30)   PDK(SEQ ID NO：15)
  巨桉COMT 485bp(SEQ ID NO：78)   Euc 4CL 500bp片段(1521-2020)(SEQ ID NO：31)   PDK(SEQ ID NO：15)
  启动子   片段   内含子
  巨桉COMT 306bp(SEQ ID NO：80)   Euc 4CL 200bp片段(1-200)(SEQ ID NO：27)   PDK(SEQ ID NO：15)
  巨桉COMT 306bp(SEQ ID NO：80)   Euc 4CL 223bp片段(201-423)(SEQ ID NO：28)   PDK(SEQ ID NO：15)
  巨桉COMT 306bp(SEQ ID NO：80)   Euc 4CL 300bp片段(551-850)(SEQ ID NO：29)   PDK(SEQ ID NO：15)
  巨桉COMT 306bp(SEQ ID NO：80)   Euc 4CL 336bp片段(1031-1378)(SEQ ID NO：30)   PDK(SEQ ID NO：15)
  巨桉COMT 306bp(SEQ ID NO：80)   Euc 4CL 500bp片段(1521-2020)(SEQ ID NO：31)   PDK(SEQ ID NO：15)
  辐射松LIM 1607bp(SEQ ID NO：79)   Euc 4CL 200bp片段(1-200)(SEQ ID NO：27)   PDK(SEQ ID NO：15)
  辐射松LIM 1607bp(SEQ ID NO：79)   Euc 4CL 223bp片段(201-423)(SEQ ID NO：28)   PDK(SEQ ID NO：15)
  辐射松LIM 1607bp(SEQ ID NO：79)   Euc 4CL 300bp片段(551-850)(SEQ ID NO：29)   PDK(SEQ ID NO：15)
  辐射松LIM 1607bp(SEQ ID NO：79)   Euc 4CL 336bp片段(1031-1378)(SEQ ID NO：30)   PDK(SEQ ID NO：15)
  辐射松LIM 1607bp(SEQ ID NO：79)   Euc 4CL 500bp片段(1521-2020)(SEQ ID NO：31)   PDK(SEQ ID NO：15)
  火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   Euc 4CL 200bp片段(1-200)(SEQ ID NO：27)   PDK(SEQ ID NO：15)
  启动子   片段   内含子
  火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   Euc 4CL 223bp片段(201-423)(SEQ ID NO：28)   PDK(SEQ ID NO：15)
  火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   Euc 4CL 300bp片段(551-850)(SEQ ID NO：29)   PDK(SEQ ID NO：15)
  火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   Euc 4CL 336bp片段(1031-1378)(SEQ ID NO：30)   PDK(SEQ ID NO：15)
  火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   Euc 4CL 500bp片段(1521-2020)(SEQ ID NO：31)   PDK(SEQ ID NO：15)
  巨桉COMT 485bp(SEQ ID NO：78)   Euc 4CL 200bp片段(1-200)(SEQ ID NO：27)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  巨桉COMT 485bp(SEQ ID NO：78)   Euc 4CL 300bp片段(551-850)(SEQ ID NO：29)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  巨桉COMT 485bp(SEQ ID NO：78)   Euc 4CL 500bp片段(1521-2020)(SEQ ID NO：31)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  巨桉COMT 306bp(SEQ ID NO：80)   Euc 4CL 200bp片段(1-200)(SEQ ID NO：27)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  巨桉COMT 306bp(SEQ ID NO：80)   Euc 4CL 300bp片段(551-850)(SEQ ID NO：29)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  巨桉COMT 306bp(SEQ ID NO：80)   Euc 4CL 500bp片段(1521-2020)(SEQ ID NO：31)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  辐射松LIM 1607bp(SEQ ID NO：79)   Euc 4CL 200bp片段(1-200)(SEQ ID NO：27)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  启动子   片段   内含子
  辐射松LIM 1607bp(SEQ ID NO：79)   Euc 4CL 300bp片段(551-850)(SEQ ID NO：29)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  辐射松LIM 1607bp(SEQ ID NO：79)   Euc 4CL 500bp片段(1521-2020)(SEQ ID NO：29)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  桉树LIM(SEQ ID NO：81)   Euc 4CL 200bp片段(1-200)(SEQ ED NO：27)   Pr4CL(SEQ ED NO：9)
  桉树LIM(SEQ ID NO：81)   Euc 4CL 300bp片段(551-850)(SEQ ID NO：29)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  桉树LIM(SEQ ID NO：81)   Euc 4CL 500bp片段(1521-2020)(SEQ ID NO：31)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   Euc 4CL 200bp片段(1-200)(SEQ ID NO：27)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   Euc 4CL 300bp片段(551-850)(SEQ ID NO：29)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
  火炬松4CL(SEQ ED NO：77)   Euc 4CL 500bp片段(1521-2020)(SEQ ID NO：31)   Pr4CL(SEQ ID NO：9)
构建体pARB339、pARB345和pARB599由美国典型培养物保藏中心(P.O.Box1549，Manassas，Virginia，USA，20108)在2004年9月21日保存且分别给予其ATCC登录号PTA-6222、PTA-6223和PTA-6225。
实例4：分离下列巨桉cDNA：CCoAOMT、C3H、C4H和CCR
构造两个巨桉cDNA表达文库(一个来自单一树木各种组织的混合物且一个来自单一树木的树叶)并按照下列筛选。
使用Chang等人的方案(Plant Molecular Biology Reporter 11：113-116，1993)自植物组织提取mRNA，其中有少许变动。具体而言，将试样溶于CPC-RNAXB(100mMTris-Cl，pH 8,0；25mM EDTA；2.0M NaCl；2％CTAB；2％PVP和0.05％Spermidine*3HCl)中并用氯仿∶异戊醇(24∶1)提取。用乙醇沉淀mRNA并使用Poly(A)QuikmRNA分离套组(Stratagene，La Jolla，CA)纯化全部RNA制备物。通过反向转录酶合成并随后按照制造商的方案使用ZAP Express cDNA合成套组(Stratagene)将所得cDNA纯系插入Lambda ZAP中来从经纯化mRNA构造cDNA表达文库。使用Gigapack II PackagingExtract(Stratagene)并用1μl试样DNA(来自5μl连接混合物)封装所得cDNA。使用XL 1-Blue MRF′细胞和XLOLR细胞(Stratagene)用ExAssist辅助噬菌体(Stratagene)对所述文库进行大块切除。切除的噬菌粒用NZY肉汤(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)稀释并铺在含有X-gal和异丙基硫基-β-半乳糖苷(IPTG)的LB-卡那霉素琼脂平板上。
在平铺和选择用于DNA miniprep的菌落中，99％含有适用于测序的插入体。在具有卡那霉素的NZY肉汤中培养阳性菌落并借助碱裂解方法和聚乙二醇(PEG)沉淀方法纯化cDNA。使用1％琼脂糖凝胶来筛选用于染色体污染的测序模板。使用TurboCatalyst 800机器(Perkin Elmer/Applied Biosystems，Foster City，CA)按照制造商的方案制备染色引物序列。
使用Perkin Elmer/Applied Biosystems Prism 377序列分析仪获得阳性纯系的DNA序列。首先自5′末端且在某些情况下也可自3′末端对cDNA纯系测序。对于某些纯系而言，使用亚克隆片段获得内部序列。通过使用限制酶图谱的标准程序并亚克隆到pBluescript II SK+载体来实施亚克隆。
使用2.0.4版FASTA算法(1996年2月)(可在因特网上于ftp站点ftp://ftp.virginia.edu/pub/fasta/获得)或BLASTN算法(2.0.4版[1998年2月24日]或2.0.6版[1998年9月16日])比较所测定cDNA序列与EMBL数据库(1996年3月46版)中的已知序列。使用冗余序列的多次比对来构建可靠的一致序列。根据与其它植物种系已知序列的相似性，将本发明的分离聚核苷酸鉴别为编码特定酶。
使用上文所述程序分离编码下列多肽的源自巨桉文库的cDNA序列：咖啡酰基CoA甲基转移酶(美国专利第6,410,718号)、肉桂酸酯-4-羟化酶(C4H)(美国专利第6,410,718号)、p-香豆酸酯-3-羟化酶(C3H)(美国专利第5,981,837号)和CCR(美国专利第6,410,718号)。
实例5.辐射松LIM表达载体的构造
按照实例2中所述构造表9中所列举的最终载体，其中有下列变动：使用不同的片段、启动子和/或内含子。使用标准PCR技术和设计类似于那些实例2中所用者的引物扩增来自辐射松LIM cDNA纯系(专利申请案第WO 00/53724号)的两个片段(SEQ ID NO：38和39)。按照实例2中所述沿正义和反义方向将辐射松LIM片段克隆到骨架载体中。通过以类似于实例2中所述的方式改变启动子来构造表9中最终载体，其含有不同于骨架载体中所含启动子的启动子。使用实例2中所述方法将yabby内含子(SEQ ID NO：64)插入最终载体中。将完整RNAi盒克隆到pART27或pART29中，如实例1和2中所述。
表9.
最终载体   其中插入RNAi盒的双元载体   驱动RNAi盒的启动子   在RNAi盒中沿正向和反向克隆的片段
  pARB348   pART27   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)   SEQ ID NO：38
  pARB352   pART27   火炬松ACL(SEQ ID NO：77)   SEQ ID NO：38
  pARB349   pART27   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)   SEQ ID NO：39
  pARB353   pART27   火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   SEQ ID NO：39
  pARB235   pART29   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)   SEQ ID NO：38
  pARB236   pART29   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)   SEQ ID NO：39
  pARB243   pART29   火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   SEQ ID NO：38
  pARB244   pART29   火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   SEQ ID NO：39
为了在松树中使用基于pART27的载体，必须重新改造构建体以移除所选盒nos::nptII。如实例2中所述，可移除NotI片段并将其插入具有NotI位点以及组成型启动子表达GUS(以检验不使用PCR时的转化)和可选标记盒(其包含受阿拉伯芥Ubq10启动子驱动的nptII)的基础载体中。载体pWVR31可用作新基础载体。
实例6.巨桉LIM表达载体的构造
按照实例2中所述构造骨架质粒。使用标准PCR技术和被设计为可向扩增片段的两个末端添加EcoRI和XbaI限制酶切位点的引物扩增来自巨桉LIM cDNA纯系(专利申请案第WO 00/53724号)的两个片段(SEQ ID NO：40和41)。沿正义方向克隆LIM片段时，使用限制酶EcoRI和XbaI切割扩增片段、使用Klenow进行平端化并将其克隆至在平端化ClaI位点含有yabby内含子和辐射松超级泛素启动子序列(实例2中所述)的骨架载体中。沿反义方向克隆LIM片段时，使用限制酶EcoRI和XbaI切割扩增片段、使用Klenow进行平端化并使用标准克隆技术将其克隆到位于平端化PstI位点的相同骨架载体中。
通过NotI限制酶消化自骨架载体移除含有启动子::正义片段::内含子::反义片段::3′UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒并使用标准克隆技术将其克隆到双元载体pART29(经NotI消化)中。为了获得表10所列的含有不同启动子的最终载体，需使用实例2中所述方法取代所述启动子序列。使用此方法构造表10中所列举载体。
表10
最终载体 驱动RNAi盒的启动子   在RNAi盒中沿正向和反向克隆的片段
  pARB489   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)   SEQ ID NO：40
  pARB490   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)   SEQ ID NO：41
  pARB491   火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   SEQ ID NO：40
  pARB492   火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   SEQ ID NO：41
实例7.松树CCoAOMT表达载体的构造
按照实例2中所述克隆下列载体，其中变动之处是使用设计类似于那些实例2中所用者并用于实例2中所述方法中的引物来扩增来自松树CCo-OMT(咖啡酰基-辅酶O-甲基转移酶)(SEQ ID NO：42)的片段。还可使用实例2中所述方法通过添加yabby内含子和使用pART27双元载体来修饰最终载体。
表11
  最终载体   启动子   片段
  pARB357   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)  SEQ ID NO：42
为了在松树中使用所述载体，必须重新改造构建体以移除所选盒nos::nptII。如实例2中所述，可移除NotI片段并将其插入具有NotI位点以及组成型启动子表达GUS(以检验不使用PCR时的转化)和可选标记盒(其包含受阿拉伯芥Ubq10启动子驱动的nptII)的基础载体中。载体pWVR31可用作新基础载体。
实例8.其它松树CCoAOMT表达载体的构造
按照实例3中所述克隆下列载体，其中变动之处是使用设计类似于那些实例4中所用者并用于实例4中所述方法中的引物扩增来自松树CCo-AOMT(咖啡酰基-辅酶AO-甲基转移酶)(SEQ ID NO：43)的片段。还可借助上文所述方法通过添加PDK内含子、使用具有内含子的辐射松超级泛素启动子或火炬松4CL启动子和使用pWVK147双元载体来修饰最终载体。
表12.
  最终载体   启动子   片段
  pARB559   辐射松超级泛素+内含子(SEQ ID NO：76)   SEQ ID NO：43
  pARB560   火炬松4CL(SEQ ID NO：77)   SEQ ID NO：43
实例9.巨桉CCoAOMT表达载体的构造
按照实例3中所述克隆下列载体，其中变动之处为使用设计类似于那些实例3中所用者并用于实例3中所述方法中的引物扩增来自巨桉(E.grandis)CCoAOMT(咖啡酰基辅酶AO-甲基转移酶)(SEQ ID NO：44)纯系的片段(在实例4中分离，其在W098/11205中作为部分序列提出)。还可借助实例3中所述方法通过添加PDK内含子或桉树木质部内含子、巨桉COMT 485bp启动子(SEQ ID NO：78))及使用pART29双元载体来修饰最终载体。
表13
  最终载体   片段   内含子
  pARB523   SEQ ID NO：44   SEQ ID NO：15
  pARB524   SEQ ID NO：44   巨桉木质部内含子
实例10.巨桉CCR表达载体的构造
按照实例3中所述克隆下列载体，其中变动之处为使用设计类似于那些实例3中所用者并用于实例3中所述方法中的引物扩增来自巨桉CCR(肉桂酰基CoA还原酶)纯系(SEQ ID NO：45)(在实例4中分离)的片段。还可借助实例3中所述方法通过添加PDK内含子或桉树木质部内含子、巨桉COMT 485bp启动子(SEQ ID NO：78))、及使用pART29双元载体来修饰最终载体。
表14
  最终载体   片段   内含子
  pARB525   SEQ ID NO：45   SEQ ID NO：15
  pARB526   SEQ ID NO：45   来自专利WO 00/22092的巨桉木质部内含子
实例11.巨桉C3H和C4H表达载体的构造
按照实例3中所述克隆下列载体，其中变动之处为使用设计类似于那些实例2中所用者并用于实例3中所述方法中的引物扩增来自巨桉C3H纯系(SEQ ID NO：46)(在实例4中分离)或巨桉C4H纯系(SEQ ID NO：47)(在实例4中分离，其在WO 00/22099中作为部分序列提出)的片段。来自巨桉的阿拉伯半乳聚糖启动子(SEQ ID NO：35)或来自火炬松的4CL启动子(美国专利第6,252,135号)用于这些载体。用BamHI限制酶消化辐射松超级泛素启动子内含子载体并使用标准技术将其克隆至含有火炬松4CL启动子(经BamHI消化)或巨桉阿拉伯半乳聚糖启动子(经ClaI消化)的Bluescript载体中。使用设计类似于那些扩增具有内含子的辐射松超级泛素启动子序列所用者的引物来扩增火炬松4CL启动子和巨桉阿拉伯半乳聚糖启动子且随后将其连接到实例3中所述的Bluescript基础载体中。还可借助实例3中所述方法通过添加Pr4CL内含子和使用pARB 1002双元载体来修饰最终载体。
表15.
  最终载体   启动子   片段
  pARB669  巨桉阿拉伯半乳聚糖2446bp(SEQ ID NO：35)  SEQ ID NO：46
  pARB670  巨桉阿拉伯半乳聚糖2446bp(SEQ ID NO：35)  SEQ ID NO：47
  pARB672  火炬松4CL(SEQ ID NO：77)  SEQ ID NO：47
实例12.对桉树中4CL构建体的评估
使用下列程序将3个含有两个不同长度的RNAi片段的不同构建体pARB339、pARB341和pARB345(见表16)转化到巨桉中。
表16.
 DNA构建体名称   构建体描述
  pARB339   驱动4CL RNAi 200bp片段的组成型启动子
  pARB341   驱动4CL RNAi 600bp片段的组成型启动子
  pARB345   驱动4CLRNA1200bp片段的维管优选启动子
使用在伸长培养基(具有1μM BAP、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS)中微体繁殖培养的克隆巨桉叶片外植体进行转化。按照Burrel等人的国际公开案第WO00/12715号中所述进行转化，所述案件以引用的方式并入本文中。
按照WO00/12715中所述选择转基因外植体，只是省略NAA且培养基含有50mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀(timentin)。将外植体在此培养基上保留2周且随后在2周后将其转移至含有100mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的培养基且再过2周将其转移至含有150mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的培养基。随后按月将培养物转移至含有150mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的新鲜培养基中直至可收集到健康的单芽。将单芽置于伸长培养基上以增殖推定的转基因组织。当可自增殖组织收集约200mg组织时，自初始外植体移除此增殖组织以用于PCR分析。使用PuRe TaqReady-To-GoTM PCR珠粒(Amersham Biosciences)按照制造商的说明书进行PCR分析以确定启动子和所选基因的存在。随后进一步用含有150mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的伸长培养基进一步增殖具有阳性PCR结果的组织并将其保留为储存培养物。
为了产生用于进一步测试的转基因植物，将一些芽置于伸长培养基上。将芽保留在此培养基上直至其高约2-3cm。如果此需要1个月以上，则每隔一个月将芽置于新鲜的培养基上。当芽高为2-3cm时，移除单芽并置于生根培养基中。在生根培养基中10天以后，将植物转移至温室中。那些熟悉植物转化和植物组织培养的人员应了解许多不同的培养基和间隔期可适于再生本发明植物。
使植物在温室中于盆栽混合物中生长6个月，使用适当的湿度方案和杀真菌剂以控制真菌生长。使植物在环境温度及毛管水灌溉下生长于网格小室中。将植物栽培在5L塑料袋中补充有缓慢释放肥料的以土壤-少量泥煤为主的堆肥中。
以破坏性方式对约6个月期的植物取样以进行木质素总量分析。
高度测量
表17列举使用卡那霉素选择并在6个月后于土壤中存活的微体繁殖植物的百分比、在植入土壤中后第20周观测的矮小植物百分比及在将经pARB339、pARB341或pARB345转化的桉树植物植入土壤中后第22周观测的植物平均高度。
经pARB341转化的植物的存活数据远远低于经pARB339或pARB345转化的植物的存活数据。在经pARB341转化并存活的全部植物中，有82％是矮小的，此表明DNA载体pARB341与其它两种载体(pARB339和pARB345)相比可在更大程度上影响植物的高度和存活率。
表17.
Figure A20058003927700371
图3和图4A中所示数据表明每一构建体对植物高度造成的明显影响。尽管经pARB345和pARB339转化的每组植物中最高的植物个体是接近的(分别为159cm和168cm)，但最矮的pARB339植物(53cm，64cm)较最矮的pARB345植物(91cm，96cm)矮很多。此图并不包含收集用于分析的矮小pARB341试样的平均高度。矮小pARB341植物的平均高度为13cm。
木质素分析
在约6个月时对按照以上实例中所述产生的转基因桉树取样以用于木质素分析。自所有待分析试样收集底部20cm茎。通过剥离自所述茎移除树皮、韧皮部和初生皮层且随后在液氮中迅速冷冻所述茎试样。按照制造商说明书在Flexi-Dry微处理器控制-耐腐蚀冻干机(Stone Ridge，New York，USA)中对冷冻试样实施冷冻干燥。在Wiley磨机(Arthur H.Thomas公司；Philadelphia，U.S.A)中研磨试样且随后在环式磨机中再次研磨。随后将所研磨试样在55℃下干燥最少1天并在此温度下储存直至使用。通过将所研磨材料悬浮于溶剂或溶液中、用超声波净化器提取、离心且随后倾倒出上清液等一系列阶段自试样分离细胞壁材料。使用下列提取顺序：两种浓度的NaCl、乙醇水溶液；CHCl3:MeOH；和丙酮。为了移除淀粉，洗涤所提取细胞壁材料，在叁-乙酸盐缓冲液中加热以使淀粉胶凝化且随后用α-淀粉酶处理。在酶处理之后，离心所述悬浮液并用乙醇和丙酮洗涤所得沉淀，使其静置过夜且随后在55℃下干燥。所分离细胞材料用于使用Fukushima，R.S.和Hatfield，R.D.(2001)J.Ag.Food Chem.49(7)：3133-9中所述方案进行的小规模木质素测定。结果示于图4A和图4B中。pARB341中的RNAi盒使所有转化植物中的矮小植物达82％。所收集的这些植物试样显示其将木质素水平减少至约正常水平的80％。当与另两种被测试载体相比时，此载体对植物高度具有最大的影响且其对减少木质素水平也有很大的影响。尽管木质素减少等级的极端的特征是矮小表现型，但在此研究中受到鉴别的所有植物中的最低木质素转基因种系(transline)(pARB345转基因种系)具有合理的正常高度。因此，在许多pARB341转化体中见到的矮小现象可能是由基因(不包括在木质化次生木质部中表达的4CL基因，例如，在植物其它部分表达的4CL基因或与4CL具有部分同源性的基因)受到抑制而造成的单独现象。
pARB345中的RNAi盒与pARB339中的RNAi盒相比能更有效地产生木质素明显减少的表现型。pARB345中的200bp RNAi盒能够使木质素减少多达-25％也不会引发在许多转化体中由600bp RNAi盒(其受pARB341中的相同启动子驱动)产生的矮化效应。
自以上木质素分析选择经pARB345转化的9株植物并使用热解分子束质谱及通过用于方法对比的固态13C NMR对从第一试样以上部位收获的第二个20cm茎试样进行木质素含量测定。所有3种方法给出近似相同的木质素减少数值。
实施热解分子束质谱时，在石英舟中称重每一试样并在由石英管(内径为2.5cm)构成的反应器中热解所述试样，其中氦以5L/min(在STP下)流过。以使分子束质谱仪的采样口位于所述石英反应器末端内部的方式放置反应管。使用采用ExtrelTMTQMS C50型质谱仪的分子束质谱仪进行热解蒸气分析，如Evans & Milne(1987)(Energy & Fuels，1：123-37)中所述。对所述反应器进行电加热且将其温度保持在550℃。尽管热解反应在不超过50秒内完成，但总的热解时间为90秒。据估计，热解蒸气在反应器热解区中的滞留时间为～75ms且其足够短以使得石英反应器中的二次裂化反应降至最低。用Teknivent Vector 2TM数据采集系统使用22eV电子碰撞电离电压获得介于20-450Da之间的质谱数据。使用此系统，可同时并实时对轻气体和重焦油取样。热解蒸气的质谱可提供分子片段的快速、半定量图示。
使用质量范围介于m/z 50与200间的pyMBMS图谱进行的主要组份分析突出显示来自木质素和碳水化合物的热解产物同时能最大程度地减少小热解片段和电子撞击片段(低于m/z 50)和提取物(高于m/z 200)。
实施木质素含量的NMR测定时，在4.7T及交叉极化(CP)和变角度旋转(MAS)下于一Bruker Avance 200MHz光谱仪中收集高分辨率、固态13C NMR质谱。使用可变振幅交叉极化(整个交叉极化期间的线性斜坡为1db)来最小化在较高MAS转速下对Hartmann-Hahn错配序列敏感的未质子化芳族碳原子的变化(S.O Smith，I.Kustanovich，X.Wu，O.B.Peersen，Journal of Magenetic Resonance(1994)104：334-339)。在53.6kHz下匹配1H和13C域并在匹配期间将1dB斜坡施加于质子r.f.。采集时间为0.033秒且扫频宽度为31.3kHz。在7000Hz速率下，进行变角度旋转。使用2ms接触时间和1.0秒脉冲重复率来平均2000-4000次扫描。在相对峰值强度方面观测到的差异及积分面积可用于确定类似试样间的差异。使用Haw等人1984(J.F.Haw.，G.E.Maciel.，H.A.Schroder，Analytical Chemistry 56：1323)的方法自芳香族(110ppm-160ppm)区和碳水化合物(40ppm-100ppm)区的积分面积计算重量％木质素数值。
使用Unscrambler 7.8版软件程序(CAMO A/S，Trondheim，Norway)进行数据分析。使用隐结构投影(PLS-1)算法(其一次仅处理1个Y-变量)来构造用于预测松树试样木质素含量的模型。使用pyMBMS谱作为X-矩阵(310个变量(m/z值介于50与360之间))并使用通过固态NMR测量的木质素数值作为Y-矩阵来形成可预知木质素含量的模型。在进行分析之前，将质谱归一化为总离子电流。使用完全交叉验证进行模型验证，其中自所述数据中系统地移除一个试样，利用其余试样建立模型且随后使用此模型来预测自数据组移除的试样的Y-变量数值。持续所述过程直至已经移除并自Y-矩阵预测全部试样。配合度(即，高相关系数)和最小剩余误差是用于选择最佳模型的标准。
自NMR木质素数值和pyMBMS谱来构造可预测木质素含量的PLS1模型。当选取来自相同种系的1株以上树木作为试样来进行NMR分析时，取各树木对应质谱的平均值并使用其构建模型。使用介于50至360间的m/z数值构造PLS模型。此范围是根据经验确定的，以便基于完全交叉验证模型的相关系数提供最佳模型。
表18显示9个所选试样的NMR结果的对比。NMR wt％木质素数值与所选试样的PCI分值的对比显示PCI分值可精确地反映火炬松试样中的木质素含量且PCI分值可用于评定不同构造物的木质素含量。在NMR测定的木质素含量与如上文所述由乙酰溴测定的含量之间也有极佳的相关性。
表18.
Figure A20058003927700391
将使用均苯三酚/HCl测定松柏醛单元的木质素组织化学测试应用于取自含有本发明DNA构建体的转基因植物侧枝的手切切片。均苯三酚(也称作Weisner试剂)是一种木质素染剂(Pomar等人，Protoplasma，220(1-2)：17-28(2002))且Maule染剂用于特定地检测紫丁香基木质素亚单位(Lewis等人，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，41：455-496(1990)。经pARB339和pARB345转化的转基因植物未显示与对照未转化植物的可观测差异。正常高度的pARB341植物也不具有与对照植物的可观测差异而矮小的pARB341植物具有降低的均苯三酚染色量，表明这些试样中的木质素水平大大地降低了。检查矮小pARB341转基因种系的染色切片，显示在转基因种系与转基因种系之间存在不同。具有特别极端的解剖学表现型的一个矮小转基因种系的两个无性系分株在其外观方面是高度一致的，表明所观测到的木质素沉积和解剖学的微扰具有(转)基因基础。也使用Maule染剂对矮小和正常高度的pARB341植物的手切切片染色。此染剂是紫丁香基木质素亚单元的特异性染剂(Strivastava LM1966.Histochemicalstudies on lignin.Tappi Journal 49：173-183)。
如同经均苯三酚染色的切片一样，在矮小植物中观测到的木质素明显少于“正常的”植物且矮小植物茎干中明显缺乏维管分化。
矮小pARB341植物由于具有粉色的木质而在表现型上也不同于其高大对应植物。这可在剥离茎干时观测到。与高大植物相比，这些植物的茎干也较软且有弹性。令人感兴趣的是，当剥去树皮、韧皮和初生皮层时，具有高大/“正常”表现型的少数pARB345植物也具有粉色木质。
通过聚焦显微镜检查来检查两个野生型试样和10个转基因试样。所检查的10个转基因试样包括5株pARB339植物，一株具有粉色木质；2株矮小pARB341植物，均具有粉色木质；和3株pARB345植物，其中2株具有粉色木质。将2-3cm长的茎干片段固定在福尔马林醋酸-酒精(FAA)中。在水中洗涤试样并使用滑动式切片机以30-60mm厚度切片。使用番红和均苯三酚/HCl对切片进行染色以供用于借助聚焦显微镜检查进行解剖学分析。一些试样使用甲苯胺蓝色染剂检查。
所有试样均含有大量及不同数量的受拉木质，其通常以缀块形式仅存在于茎干的一侧。其特征为具有或多或少未木质化次生壁的极厚壁纤维。在所有试样的受拉木质中，木质化程度的减少通过均苯三酚/HCl所染红色的减少和经番红染色后绿色荧光的增加及通过使用甲苯胺蓝色所染粉色来证实。为了自受拉木质效应辨别转基因表现型，使用聚焦显微镜检查法及番红染色(且亦使用均苯三酚/HCl染色)对所有试样中未显示典型受拉木质染色图案的正常木质茎干区进行检查。大多数试样中的正常纤维或导管细胞壁组成没有明显改变的迹象。来自pARB341转基因树木的2个试样显示表明细胞壁组成发生变化的解剖学表现型：导管直径明显减少且导管细胞壁呈现波浪形外观。这些试样中的至少一个还显示了木质部(木髓中的木质化组织)外侧的变化。然而，应注意的是来自上文所鉴别的非矮小低木质素试样的试样未显示可通过聚焦显微镜检查法测定的解剖学异常。结果表明本发明构建体可导致出现生长高度、木质素含量减少和解剖学表现型改变的各种组合。因此，所揭示方法能够产生和选择呈现最佳表现型组合的转基因树木以用于生产纸浆或其它木制品。
实例13.对火炬松中4CL构建体的评估
使用PyMBMS评估木质素
火炬松(Pinus taeda)和杂交松树(火炬松x刚松)胚细胞系是使用美国专利第5,856,191号中所述方案自单独不成熟雌配子的合子胚产生并使用美国专利第5,506,136号中阐述的方案保持。
在维持培养基上培养1-3个月之后，冻存组织培养物，储存长达数年时间并随后使用美国专利第6,682,931号的方法复苏。熟悉植物组织培养技术的人员应了解，其它冻存和恢复方案均可应用于本方法且不应将此实例的详细阐述诠释为限制所述方法的应用。
通过按照美国专利第5,491,090号的方法用1g每种组织接种250ml Nephelo带侧壁的烧瓶(Kontes Chemistry and Life Sciences Products)来建立来自每一种基因不同组织培养细胞系的均匀悬浮培养物。将含有存于液体培养基中的细胞的烧瓶置于处于23℃+2℃温度的黑暗培养室中且以100rpm转动的旋转振荡器上。一周后，通过向培养烧瓶中注入15ml新鲜培养基使每个烧瓶中液体达35ml并旋动以使细胞分布均匀。通过将细胞和培养基倾倒入烧瓶的侧壁部分、使细胞沉降30分钟并随后测量沉降细胞体积(SCV)来测量细胞生长。当SCV大于或等于最大SCV的一半(烧瓶体积的50％被植物细胞占据)时，将各培养物转移至总共含有80ml细胞和培养基的500ml带侧壁的烧瓶中并将转移培养物保持在相同的条件下。
准备进行基因转移时，通过高压蒸汽灭菌对聚酯膜载体进行灭菌并将其置于单独的无菌布氏漏斗中，且对于每种细胞系的6个复制板中的每一个，将1-3毫升松树胚性悬浮液移至各载体以便胚组织均匀地分布。自所述组织抽吸液体培养基并按照美国专利公开案第20020100083号中所述的方法将具有胚形成组织的各载体置于用于土壤杆菌培育的凝胶化准备培养基上。具体而言，通过所属领域的技术人员所熟知的技术将双元构建体pWVC60、pWVC62、pWVK158、pWVK154、pWVK157、pWVK155、pWVK143、pWVC46、pWVC40、pWVC43和pWVC44各自导入不同的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分离物中，且在通过常用技术施与乙酰丁香酮时引发毒性，此时将每种经诱导土壤杆菌分离物与植物材料的各复制品混合。将这些细胞在黑暗中于22℃+2℃下共同培养约72小时。
在共同培养后，按照美国专利公开案第20020100083号中所述的方法自所述培养物去除土壤杆菌。然后以2周间隔将聚酯膜载体上载有的细胞转移至新鲜的选择培养基中。在许多培养皿上众多隔离区中的选择培养基上均发生了积极生长。在选择试剂存在下此积极生长通常表示生长组织已经将选择基因整合入其染色体中并受到稳定转化。这些积极生长的区域被视为独立转化事件且因此被称作推定的转基因亚系。通过将生长转基因扇区转移至补充有相应选择试剂的新鲜半固体维持培养基中可增加推定的转基因胚形成组织。
在达到约2g之后选择推定的转化亚系使用标准技术实施聚合酶链反应(PCR)扩增以验证转基因的存在。
表19.用于PCR的引物对(SEQ ID NO 68-75，分别按照出现顺序给出)
Figure A20058003927700421
也可使用来自每一亚系的材料进行GUS染色和显微镜检查。对于GUS染色，通过按照植物转化技术中熟知的技术对来自各转基因细胞系的细胞在暴露于生色葡糖醛酸酶酶底物“X-gluc”(可自Inalco购得)后进行深蓝染色来检测被插入uidA基因(其编码在组织培养细胞中表达的酶β-葡糖醛酸酶)。显微镜检查表明细胞分化已经恢复且uidA转基因的瞬时表达对这些轰击展现正常的频率。
可发芽的胚按照下列制备。当已经在选择培养基上培养的细胞团增殖到至少1克后，将每一细胞团再次分别重新悬浮于液体培养基中。当使细胞悬浮液成为均匀的(最大值的一半)SCV时，将等量的悬浮培养细胞转移到无菌膜载体上并将其置于如美国专利第5,506,136号所述的发育/成熟培养基上以形成可收获的高品质第3阶段(子叶)胚。在黑暗生长室中于23+2℃下培育培养皿。每3周将膜载体转移到含有新鲜培养基的新陪替氏培养皿(petri dish)中。在第9周时，以目测方式分析第3阶段(子叶)胚的发芽品质并收获到美国专利第5,506,136号所述培养基上的纤维载体上并在黑暗中于4℃±2℃的温度下培育约4周。接下来，在黑暗中于25℃±2℃温度下将其纤维载体上的胚在密封容器中的水上培育约3周。在进行以上两次处理之后，将其纤维载体上的胚转移至发芽培养基并在黑暗中于25℃±2℃的温度下将其培育约3天。然后自其纤维载体移除胚并将其置于新鲜发芽培养基的表面上。在光中于25℃±2℃的温度下进行发芽。每周检查一次发芽平板，持续约4周，并将发芽胚转移到含有100ml发芽培养基的
Figure A20058003927700422
箱中以转化成幼苗。将含有正在发育幼苗的
Figure A20058003927700423
箱在光中于25℃±2℃下培育约8-12周。
当幼苗形成上胚轴(约2-4cm的新生芽)时，将其转移至填充有盆栽用混合物[2∶1∶2的泥炭∶珍珠岩∶蛭石，含有602g/m3 OSMOCOTE肥料(18-6-12)、340g/m3白云石石灰和78g/m3MICRO-MAX微量营养混合物(Sierra Chemical公司)]的容器中。使所述幼苗生长在阴暗的温室中并偶尔喷洒水雾，达约2周时间。使其脱离水雾以在温室环境中适应约4周。然后将幼苗转移至室外阴凉处达约6周以适应最终环境，然后移到完全日晒条件下。然后使这些幼苗在容器中生长直至条件允许田间种植。
测量经上述RNAi载体转化的5个月期火炬松树的高度并记录结果(表20)。对高度数据进行邓肯多重范围(Duncan Multiple Range)检验且发现经含有pWVK157、pWVK155、pWVC40、pWVC43和pWVC44的RNAi盒的载体转化的植物与GUS对照植物(pWVC41)相比不具有任何明显的高度差别，而所有其它经转化系与对照相比均显示明显的高度差异。还测得单一未转化对照的高度为21.1cm但没有对此试样进行统计学分析，因为所述高度为单一结果而非多个试样的平均值。在5个月时测量所有经转化树木和对照树木的根部干重但没有观测到对照试样与转基因试样之间存在明显的差异。
通过自每一茎干切割约20mg组织自以上经转化树木或对照未转化树木收集约200个7个月期的试样。在石英舟中对每一试样称重并在由石英管(内径为2.5cm)构成的反应器中热解所述试样，其中氦以5L/min(在STP下)流过。以使分子束质谱计的采样口位于石英反应器末端内部的方式放置反应管。使用采用ExtrelTM ModelTQMS C50质谱仪的分子束质谱仪进行热解蒸气分析，如Evans & Milne(1987)(Energy& Fuels，1∶123-37)中所述。对所述反应器进行电加热且将其温度保持在550℃。尽管热解反应在不超过50秒内完成，但总的热解时间为90秒。据估计，热解蒸气在反应器热解区中的滞留时间为～75ms且其足够短以最大程度地减少石英反应器中的二次裂化反应。用Teknivent Vector 2TM数据采集系统使用22eV电子碰撞电离电压获得介于20-450Da之间的质谱数据。使用此系统可同时并实时对轻气体和重焦油取样。热解蒸气的质谱可提供分子片段的快速、半定量图示。
连续两天以成段方式收集火炬松试样组和标准试样的复制物质谱以减少可能由于光谱仪每天偏移引起的与数据分析相关的问题。对两天所收集质谱的组合分析表明仅存在最小的光谱仪偏移。
检查所述光谱可确定转基因试样的质谱不同于对照的质谱。来自转基因和对照火炬松试样的热解产物的pyMBMS谱的实例示于图14中。
使用介于m/z 50与200之间质量范围的火炬松pyMBMS谱的主要组份分析突出显示来自木质素和碳水化合物的热解产物同时最大程度地减少小热解片段和电子撞击片段(低于m/z 50)和提取物(高于m/z 200)。通过选择含有较多关于木质素的信息和较少关于提取物的信息的质量范围，构建体之间的明显差异会变得明了。图15A显示对于所有所分析转基因试样使用m/z 50-200质量范围所收集的质谱的PCI分值对PC2分值的散点图。自此散点图，我们可得出如下结论：经某些载体转化的植物与对照未转化植物相比显示明显的不同，这是因为自质谱分析和PC装载所测定的木质素数量不同，而其它则没有明显不同。图15B、16A和16B提供额外的鉴别信息。经pWVC41转化的树木是GUS对照转基因树木且其未显示不同于对照未转化树木。经pWVC40和pWVK154转化的树木均含有编码松树4CL片段D的序列(SEQ ID NO：21)且经pWVC46和pWVK158转化的树木均含有编码松树4CL片段C的序列(SEQ ID NO：20)。这些转化体中的每一个在散点图上与对照试样分开，此表明转基因试样与对照试样之间的木质素数量是不同的。
图17显示图16A中所选试样(即对照、转基因试样pWVC40和pWVK154)的扩展质谱区。很明显，由木质素热解产生的峰值相对于可赋予碳水化合物和提取物(参见表21)的其它峰值有所降低。对其它构建体进行类似的质谱分析表明PC1可反映每一试样中的木质素浓度。图15-16中右侧试样具有最高的木质素含量且左侧试样具有远低于其的木质素含量。
经pWVK158、pWVK154、pWVC46和pWVC40转化的7个月期火炬松树显示：当与未转化对照和GUS转化对照相比时，木质素含量减少最大。经pWVK158、pWVK154和pWVC42转化的树木较未转化和GUS转化树木明显更矮，而经pWVC40转化的树木具有明显木质素减少但无明显高度减少。
使用核磁共振谱评估木质素
在4.7T及交叉极化(CP)和变角度旋转(MAS)下于Bruker Avance 200MHz光谱仪中收集高分辨率、固态13C NMR谱。使用可变振幅交叉极化(整个极化期间的线性斜坡为1db)来最小化在较高MAS转速下对Hartmann-Hahn错配序列敏感的未质子化芳族碳原子的变化(S.O Smith，I.Kustanovich，X.Wu，O.B.Peersen，Journal of MageneticResonance(1994)104：334-339)。在53.6kHz下匹配1H和13C域并在匹配期间将1dB斜坡施加于质子r.f.。采集时间为0.033秒且扫频宽度为31.3kHz。在7000Hz速率下，进行变角度旋转。使用2ms接触时间和1.0秒脉冲重复速率来平均2000-4000次扫描。在相对峰值强度方面观测到的差异及积分面积可用于鉴别类似试样间的差异。使用Haw等人1984(J.F.Haw.，G.E.Maciel.，H.A.Schroder，Analytical Chemistry 56：1323)的方法自芳香族(110ppm-160ppm)区和碳水化合物(40ppm-100ppm)区的积分面积计算重量％木质素数值。
根据其PC1分值选择12个试样并使用固态13C NMR测定木质素含量。在某些情况下，将来自相同种系的若干试样组合以获得一足够大的试样以供NMR分析。图18显示对照种系(两个试样组合)与转化种系pWVK154(四个试样组合)的NMR谱的对比。NMR谱证实了pyMBMS分析的结果，即pWVK154转基因种系较对照种系具有低得多的木质素含量。通过结合对木质素和碳水化合物结构的某些假定对芳香族区和碳水化合物区进行积分来确定重量％木质素(参见Haw等人，(1984)AnaIyticaIChemistry，56：1323)。12个所选试样的结果在表22中给出。利用所选试样的PC1分值进行的NMR wt％木质素数值对比显示，PC1分值可精确地反映火炬松试样中的木质素数量且PC1记分可用于评定不同构建体的木质素含量。
使用多变量数据分析评估木质素
使用Unscrambler 7.8版软件程序(CAMO A/S，Trondheim，Norway)进行数据分析。使用隐结构投影(PLS-1)算法(其一次仅处理1个Y-变量)来构造用于预测松树试样木质素含量的模型。使用pyMBMS谱作为X-矩阵(310个变量(m/z值介于50与360之间))并使用通过固态NMR测量的木质素数值作为Y-矩阵来形成可预知木质素含量的模型。在进行分析之前，将质谱归一化为总离子电流。使用完全交叉验证进行模型验证，其自所述数据中系统地移除一个试样，利用其余试样建立模型且随后使用此模型来预测自数据组移除的试样的Y-变量数值。持续所述过程直至移除并自Y-矩阵预测全部试样。配合度(即，高相关系数)和最小剩余误差是用于选择最佳模型的标准。
自NMR木质素数值和pyMBMS谱构造可预测木质素含量的PLS1模型。当选取来自相同种系的1株以上的树木作为试样来进行NMR分析时，取所述树木的对应质谱的平均值并使用其构建模型。使用介于50至360之间的m/z值构造PLS模型。此范围是以经验方式确定的，以便基于完全交叉验证模型的相关系数提供最佳模型。示于图19中的最终完全交叉验证模型具有0.9的RMSEP和0.94的r2值。
使用由National Renewable Energy Laboratory(Golden，Colorado)研发的基于NMR的模型测定每一转化种系的木质素水平。表20显示每一RNAi构建体与未转化对照相比的木质素百分比。所有转化体显示木质素相对于对照植物有所减少，但不同的种系具有不同数量的木质素。包含具有片段C或D的构建体的转化体显示最大的木质素减少。
表20.RNAi构建体对木质素水平的影响
图10提供显示自每一转化体所获得的木质素数值的图形。所述构建体是按照沿x-轴的平均高度顺序列出。因此，所述结果显示：在松树中，片段C和D与生长以及木质素的平均减少相关。片段E既不减少生长，也不在很大程度上减少木质素。自片段A(受任何启动子驱动)或片段F(受4CL启动子驱动)可见，最佳木质素减少并不伴随平均生长减少。这些构建体构成森林学应用的适当表现型。表21提供与火炬松木头试样的热解分子束质谱相关的质谱峰值分配(Evans等人，Energy & Fuels，1：123-137(1987))。
表21.
Figure A20058003927700461
1片段离子。
表22：通过NMR测得的木质素重量％数值
Figure A20058003927700462
实例14.松树转化体的田间测试
从122行中的每一行中选出4-8个基因等同的繁殖体(无性系分株)用于田间种植，对于16个构建体的每一个均包含约相等数量的行，共以随机划块设计方式种植约1000株树苗。将经4CL启动子驱动的构建体和超级泛素启动子驱动的构建体转化的细胞系种植于约500株树苗的单独区块(各自具有对应的对照)中。
表23中用星号标记的构建体产生至少一些矮小转化体。自所述表中可见，具有受超级泛素启动子驱动的构建体的转化体更有可能显示矮小。同时，具有受4CL启动子驱动的构建体的转化体更有可能显示木质素减少而没有明显的矮化现象，如可自下表23中所见，其中运用邓肯多重范围检验来测量高度。在表23中可观测到，较大高度类别中主要呈现含有受维管优选型启动子驱动的构建体的转化体。因此，具有组织优选型启动子的构建体较佳。
表23.在田间测试中种植的4CL RNAi转化树木和对照树木。
按照转基因树木的平均高度(在第8个月时测量)和根部质量(在第12个月时测得，即在植入田间时)进行评定
  启动子  4CL基因的RNAi片段   显示矮化的某些事件   高度(厘米)   Duncan群组的高度   根部质量(克，干重)   Duncan群组的根
  4CL   GUS   21.4   A   2.31   ab
  4CL   E4CL片段   19.1   ab   2.29   ab
  SUBQ   F4CL片段   18.9   A   2.47   a
  4CL   F4CL片段   17.6   ab   2.3   ab
  4CL   D4CL片段   17.2   ab   2.16   ab
  SUBQ   E4CL片段   16.5   ab   1.91   b
  4CL   A4CL片段   15.6   bc   2.25   ab
  4CL   C4CL片段   *   12.5   cd   1.93   ab
  SUBQ   A4CL片段   *   12.5   cd   2.25   ab
  SUBQ   C4CL片段   *   11.4   d   1.85   b
  SUBQ   D4CL片段   *   10   de   1.84   b
  SUBQ   B4CL片段   *   7.7   e   2.13   ab
对高度和根部质量统计进行邓肯多重范围检验。
实例15.碳水化合物水平的评估
次生木质部(木材)主要由纤维素(一种线性葡萄糖聚合物)、半纤维素(一种被发现与纤维素相关的线性杂多糖；在裸子植物中，主要的组份糖是甘露糖)和木质素(一种不能够通过水解来解聚的酚类聚合物)组成。不同水平的碳水化合物(CHO)和木质素可影响树木在诸如制浆等过程中的使用。纤维素是纸浆产品的主要组份且产率还可受与纤维素相关的半纤维素的数量和类别的影响。另外，木材的纤维素含量与强度正相关，其对于纸浆和实木制品均非常重要。
Harding等人(1999)(Nat Biotechnol.17(8)：808-12)发现具有较低木质素水平的转基因白杨树显示升高的CHO水平。Harding等人认为CHO水平的升高归因于具有较低木质素水平的树木保存了植物结构完整性且这些树木会显示对制浆更有用。
可测试总木质素数量被测试的转基因植物材料的碳水化合物(CHO)，其作为所存在纤维素和半纤维素数量的量度。对不含提取物的磨碎试样进行碳水化合物分析。这些试样用72％硫酸分2个阶段水解，首先通过在室温下培育1/2小时、然后在120℃下培育1小时、倒出并通过离子层析来分析。自层析图确定阿拉伯聚糖、半乳聚糖、葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的百分比干木重量(DWW)。
Hu等人(1999)(Nature Biotechnology 17：808-812)阐明：下调4CL基因的转基因白杨树呈现高达45％的木质素含量减少和15％的纤维素含量增加。估测实例15中被测试木质素的转基因树木的碳水化合物水平可确定这些构建体是否显示木质素含量减少与纤维素含量增加之间的相关性。
转基因树木CHO的测定结果表明与经转化树木中纤维素或半纤维素含量的变化相关的那些构建体。这些结果表明这些构建体能够调节与纸浆产率及纸浆纤维和实木制品的强度相关的纤维素含量。
所述构建体可改变经转化树木中的纤维素或半纤维素含量。经转化树木的木质素水平减少和CHO水平增加可为纸浆工业提供经济和环保优势。具体而言，木质素含量减少会减少制浆和漂白过程中所用的化学品。
实例16.用于分析木质素含量的其它方法
在此实例中，对先前在实例13中检查的树木基因纯系的较老试样进行解剖学分析以比较6个月期植物与约18个月期植物之间的转基因植物细胞结构和木质素含量。另外，通过聚焦显微镜检查法检查其木质素总量、CHO数量被测试且在实例11和13中分别被微浆化的转基因植物材料以观看所存在的细胞结构。
将试样固定于福尔马林醋酸-酒精(FAA)中。在水中洗涤试样并使用滑动式切片机以30-60mm厚度切片。使用番红染色对切片进行染色并使用聚焦显微镜检查。
还对所述试样施用木质素组织化学测试，其使用均苯三酚/HCl测定松柏醛单元。一些试样还使用作为木质素另一染剂的甲苯胺蓝色染剂进行检查。此解剖学分析可鉴别所存在反应木头的数量和转基因植物的木头(木质部)细胞是否相对于对照植物显示任何不同。
这些结果表明：在实例12和13中显示具有减少木质素水平但显示正常形态学的转基因树与具有“正常”/较高木质素水平的非转基因树在细胞结构方面不存在明显的不同。这些结果进一步证明：所观测的6个月期树木的细胞结构与所观测到的18个月期树木试样的细胞结构是一致的。
实例17.低木质素树木的加工
为了测定木质素含量降低是否转化成了对制浆工艺的改进，可对所述实例的转基因树木进行微浆化。用于确定牛皮纸制浆木材资源适宜性的重要参数为纸浆产率、制浆速率、碱耗量、纤维品质和纸浆漂白性能。木头试样经空气干燥、制成碎片且然后在烘箱中于105℃下干燥至少2天直至达到恒定重量。在连接到Stalsvets多消化器制浆单元(
Figure A20058003927700491
Sweden)的旋转臂的150mL不锈钢反应器中进行牛皮纸制浆。所述反应器旋转通过聚乙烯浴，所述聚乙烯浴由具有12.5kW总容量的电加热器加热并由Omron控制器(Omron公司，Illinois，USA)来控制。典型的制浆条件为：
有效的碱量：14％(以Na2O计)
液体硫化率：30％
液体∶木材比率：6∶1
最高制浆温度：170℃
到达最高温度的时间：90分钟
H-因子：通过改变170℃下的时间来测定
那些熟悉纸浆制造技术的人员应理解：微制浆条件的许多其它组合亦可用于测试本发明树木的木头可制浆性。所述反应器在冷水中骤冷并使用布氏漏斗过滤出经烹煮的碎片。保留滤液以用于残留碱分析。用自来水充分洗涤经烹煮碎片且随后在标准英式粉碎机中掺合15分钟。所得纸浆用布氏漏斗过滤并用水洗涤直至滤液为清澈的。将纸浆垫在60℃下干燥过夜并通过称重测定总产量。
残留碱通过用0.5M盐酸滴定至第一个拐点来测定(Milanova，E.and Dorris，G.M.，Nordic Pulp and Paper Research Jl.，9(1)，4-9(1994))。碱耗量是碎片上的有效碱量与黑色液体中残留碱之差，表示为烘箱干燥碎片的百分比(以Na2O计)。
纸浆κ数值通过半阶改变Appita Standard 201m-86(AS/NZS 1301.201s：2002)来确定。制浆速率计算为达到给定烹煮时间的κ数值。
纸浆漂白性能通过在10％稠度下使用D-Eo-D序列(Kibblewhite等人，Appita，51(2)，1145-121(1998))按照下述对纸浆漂白来测定：D阶段：0.25活性氯系数，100％工业二氧化氯，50℃，60分钟。Eo阶段：2％NaOH，0.25mPaO2，70℃，60分钟。D阶 段：1％ClO2，70℃，180分钟。在漂白之后，于pH 4-5.5下制备5g亮度垫并在23℃/50％RH下使用L & W Elrepho(Lorentzen & Wettre，Kista，Sweden)平衡后测定亮度。使用Kaman Fiberglas系统(Mets Automation，Kaman，Finland)分析诸如平均纤维长度、宽度和管腔尺寸等纤维性质和标准偏差。
结果与转化中所用类型的构建体相关且表明所述构建体可有效地调节牛皮纸制浆所用木材资源的适宜性。
实例18.反义构建体
生成反义转录本的表达构建体可用于调控植物中的木质素含量。在此方面，本文所揭示任何启动子均可与来自本文所揭示任何基因的序列组合以产生可生成反义转录本的重组构建体。利用巨桉4CL基因的若干示范性表达盒提供于表24中。pARB1201、pARB598、pARB411和pARB412的载体图谱分别提供于图20、图21和图27中。
构建体pARB598由美国典型培养物保藏中心(P.O.Box 1549，Manassas，Virginia，USA，20108)在2004年9月21日保存且给予ATCC登录号PTA-6224。
表24.
  载体   启动子   基因
  pARB1201   辐射松4CL(SEQ ID NO：77)   4CL反义(SEQ ID NO：82)
  pARB598   辐射松4CL(SEQ ID NO：77)   4CL反义(SEQ ID NO：82)
  pARB411   桉树阿拉伯半乳糖(SEQ ID NO：35)   4CL反义(SEQ ID NO：82)
  pARB412   辐射松4CL(SEQ ID NO：77)   4CL反义(SEQ ID NO：82)
实例19.4CL的正义构建体
用于调节植物中木质素的构建体还可通过组合本文所揭示任何启动子与所定向4CL基因的至少一部份来制备以生成正义转录本。这些构建体产生高水平的可抑制靶基因表达的4CL正义转录本。示范性构建体是pARB368，其图示于图25中。此构建体的表达盒包括辐射松4CL启动子(SEQ ID NO：77)，其以可操作方式连接到按照美国专利第6,410,718号所述分离的来自巨桉的全长4CL cDNA(SEQ ID NO：84)。
实例20.包含Cald5H的构建体
用于调节植物中木质素的构建体可通过组合本文所揭示任何启动子与Cald5H基因的至少一部分来制备。这些构建体可通过变更转化体中愈创木基：紫丁香基木质素单体比率来改变转基因植物的木质素组成。若干示范性表达盒提供于表25中。所述载体的质粒图谱提供于图20-22、图24和图28中。将这些构建体的每一个设计为过度表达Cald5H并由此评定转化植物中的紫丁香基含量。这些构建体中所用Cald5H基因(SEQ ID NO：83)自枫香树木质部cDNA文库分离，如美国专利第6,252,135号所述。
表25.
Figure A20058003927700511
实例21.包含SAD的构建体
用于调节植物中木质素的构建体可通过组合本文所揭示任何启动子与SAD基因的至少一部分来制备。这些构建体可通过变更转化体中愈创木基：紫丁香基木质素单体比率来改变转基因植物的木质素组成。若干示范性表达盒提供于表26中。所述载体的质粒图谱提供于图25-26中。将这些构建体的每一种设计为过度表达SAD并由此评定转化植物中的紫丁香基含量。这些构建体中所用EGBA SAD基因(SEQ ID NO：85)自巨桉cDNA文库分离，所述文库自成熟的芽蕾产生这些构建体中所用EHUA SAD基因(SEQ ID NO：86)是自cDNA文库分离，所述cDNA文库自发育的桉树伞状花序(未开放伞状蕾)产生。这些cDNA文库可按照实例2中所述制备。
表26.
    载体     启动子     基因
    pARB486     辐射松超级泛素(SEQ ID NO：76)     EGBA SAD(SEQ ID NO：85)
    pARB487     桉树阿拉伯半乳糖(SEQ ID NO：35)     EGBA SAD(SEQ ID NO：85)
    pARB488     桉树阿拉伯半乳糖(SEQ ID NO：35)     EHUA SAD(SEQ ID NO：86)
表27提供本文所述许多聚核苷酸和DNA构建体的核酸序列。
Figure A20058003927700521
Figure A20058003927700531
Figure A20058003927700541
Figure A20058003927700551
Figure A20058003927700561
Figure A20058003927700571
Figure A20058003927700581
Figure A20058003927700591
Figure A20058003927700601
Figure A20058003927700621
Figure A20058003927700631
Figure A20058003927700641
Figure A20058003927700651
Figure A20058003927700661
Figure A20058003927700671
Figure A20058003927700681
Figure A20058003927700691
Figure A20058003927700701
Figure A20058003927700711
Figure A20058003927700731
Figure A20058003927700741
Figure A20058003927700751
Figure A20058003927700761
Figure A20058003927700771
Figure A20058003927700791
Figure A20058003927700801
Figure A20058003927700811
Figure A20058003927700821
Figure A20058003927700831
Figure A20058003927700851
Figure A20058003927700861
Figure A20058003927700871
序列表
<110>阿博根有限公司
<120>植物木质素含量的调控
<130>044463-0348
<140>10/946,650
<141>2004-09-22
<160>77
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成连接子
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aattcgtcca gcagttgtct ggagctccac cagaaatctg ga    42
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<212>DNA
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<223>人工序列的名称：合成连接子
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<223>人工序列的名称：合成引物
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<220>
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<212>DNA
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<223>人工序列的名称：合成引物
<400>8
tttctgcagc ttgaaattga aatatgacta acgaat                            36
<210>9
<211>402
<212>DNA
<213>辐射松
<400>9
caggtcagta atcttaactt cccttttgaa aactcttaag aatgaaaatt tatcttaaat  60
ttagaaactt tggctgatct ttcgaaaatc tgctaaattt tttggaacct tggccgatct 120
tttaaaaata tgcgaattct tttagcaatc tacaaatctt tttaaaatat ataattgaaa 180
atctgctaaa tttgttggaa ccttgactgt tctttttaaa atatgcaaat tcttttagca 240
acttgcaaat tctttagcaa tctacaaatc tttttaaaac atataaatga aaatggacca 300
atttttctag cccctaaatt ttttctagcc ccttgctttt ccttccaaat accctaccta 360
attttgcatc taacaggccc aatcatttaa ccttttcagg gc                    402
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>10
ctcgagcagg tcagtaatct taacttccct t                                31
<210>11
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>11
ctcgaggccc tgaaaaggtt aaatgattgg g                                31
<210>12
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>12
gaattcctgc agaagcttat  ccttgggcag ggatacggca tgac              44
<210>13
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>13
gaattcctgc agaagcttga ttagcaggat ccacctggaa gcctttatat  tg    52
<210>14
<211>3799
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成核苷酸构建体
<400>14
ggccgcaaaa cccctcacaa atacataaaa aaaattcttt atttaattat caaactctcc   60
actacctttc ccaccaaccg ttacaatcct gaatgttgga aaaaactaac tacattgata  120
taaaaaaact acattacttc ctaaatcata tcaaaattgt ataaatatat ccactcaaag  180
gagtctagaa gatccacttg gacaaattgc ccatagttgg aaagatgttc accaagtcaa  240
caagatttat caatggaaaa atccatctac caaacttact ttcaagaaaa tccaaggatt  300
atagagtaaa aaatctatgt attattaagt caaaaagaaa accaaagtga acaaatattg  360
atgtacaagt ttgagaggat aagacattgg aatcgtctaa ccaggaggcg gaggaattcc  420
ctagacagtt aaaagtggcc ggaatcccgg taaaaaagat taaaattttt ttgtagaggg  480
agtgcttgaa tcatgttttt tatgatggaa atagattcag caccatcaaa aacattcagg  540
acacctaaaa ttttgaagtt taacaaaaat aacttggatc tacaaaaatc cgtatcggat  600
tttctctaaa tataactaga attttcataa ctttcaaagc aactcctccc ctaaccgtaa  660
aacttttcct acttcaccgt taattacatt ccttaagagt agataaagaa ataaagtaaa  720
taaaagtatt cacaaaccaa caatttattt cttttattta cttaaaaaaa caaaaagttt  780
atttatttta cttaaatggc ataatgacat atcggagatc cctcgaacga gaatctttta  840
tctccctggt tttgtattaa aaagtaattt attgtggggt ccacgcggag ttggaatcct  900
acagacgcgc tttacatacg tctcgagaag cgtgacggat gtgcgaccgg atgaccctgt  960
ataacccacc gacacagcca gcgcacagta tacacgtgtc atttctctat tggaaaatgt 1020
cgttgttatc cccgctggta cgcaaccacc gatggtgaca ggtcgtctgt tgtcgtgtcg 1080
cgtagcggga gaagggtctc atccaacgct attaaatact cgccttcacc gcgttacttc 1140
tcatcttttc tcttgcgttg tataatcagt gcgatattct cagagagctt ttcattcaaa 1200
ggtatggagt tttgaagggc tttactctta acatttgttt ttctttgtaa attgttaatg 1260
gtggtttctg tgggggaaga atcttttgcc aggtcctttt gggtttcgca tgtttatttg 1320
ggttattttt ctcgactatg gctgacatta ctagggcttt cgtgctttca tctgtgtttt 1380
cttcccttaa taggtctgtc tctctggaat atttaatttt cgtatgtaag ttatgagtag 1440
tcgctgtttg taataggctc ttgtctgtaa aggtttcagc aggtgtttgc gttttattgc 1500
gtcatgtgtt tcagaaggcc tttgcagatt attgcgttgt actttaatat tttgtctcca 1560
accttgttat agtttccctc ctttgatctc acaggaaccc tttcttcttt gagcattttc 1620
ttgtggcgtt ctgtagtaat attttaattt tgggcccggg ttctgagggt aggtgattat 1680
tcacagtgat gtgctttccc tataaggtcc tctatgtgta agctgttagg gtttgtgcgt 1740
tactattgac atgtcacatg tcacatattt tcttcctctt atccttcgaa ctgatggttc 1800
tttttctaat tcgtggattg ctggtgccat attttatttc tattgcaact gtattttagg 1860
gtgtctcttt ctttttgatt tcttgttaat atttgtgttc aggttgtaac tatgggttgc 1920
tagggtgtct gccctcttct tttgtgcttc tttcgcagaa tctgtccgtt ggtctgtatt 1980
tgggtgatga attatttatt ccttgaagta tctgtctaat tagcttgtga tgatgtgcag 2040
gtatattcgt tagtcatatt tcaatttcaa gcgatccccc gggctgcaga agcttatcct 2100
tgggcaggga tacggcatga cagaagcagg cccggtgctg gcaatgaacc tagccttcgc 2160
aaagaatcct ttccccgtca aatctggctc ctgcggaaca gtcgtccgga acgctcaaat 2220
aaagatcctc gatacagaaa ctggcgagtc tctcccgcac aatcaagccg gcgaaatctg 2280
catccgcgga cccgaaataa tgaaaggata tattaacgac ccggaatcca cggccgctac 2340
aatcgatgaa gaaggctggc tccacacagg cgacgtcggg tacattgacg atgacgaaga 2400
aatcttcata gtcgacagag taaaggagat tatcaatata aaggcttcca ggtggatcct 2460
gctaatcaag cttctgcagg aattcgtcca gcagtctcga gcaggtcagt aatcttaact 2520
tcccttttga aaactcttaa gaatgaaaat ttatcttaaa tttagaaact ttggctgatc 2580
tttcgaaaat ctgctaaatt ttttggaacc ttggccgatc ttttaaaaat atgcgaattc 2640
ttttagcaat ctacaaatct ttttaaaata tataattgaa aatctgctaa atttgttgga 2700
accttgactg ttctttttaa aatatgcaaa ttcttttagc aacttgcaaa ttctttagca 2760
atctacaaat ctttttaaaa catataaatg aaaatggacc aatttttcta gcccctaaat 2820
tttttctagc cccttgcttt tccttccaaa taccctacct aattttgcat ctaacaggcc 2880
caatcattta accttttcag ggctcgagaa tctggaagct tatcggaagc ttgattagca 2940
ggatccacct ggaagccttt atattgataa tctcctttac tctgtcgact atgaagattt 3000
cttcgtcatc gtcaatgtac ccgacgtcgc ctgtgtggag ccagccttct tcatcgattg 3060
tagcggccgt ggattccggg tcgttaatat atcctttcat tatttcgggt ccgcggatgc 3120
agatttcgcc ggcttgattg tgcgggagag actcgccagt ttctgtatcg aggatcttta 3180
tttgagcgtt ccggacgact gttccgcagg agccagattt gacggggaaa ggattctttg 3240
cgaaggctag gttcattgcc agcaccgggc ctgcttctgt catgccgtat ccctgcccaa 3300
ggataagctt ccgatgggtg ttatttgtgg ataataaatt cgggtgatgt tcagtgtttg 3360
tcgtatttct cacgaataaa ttgtgtttat gtatgtgtta gtgttgtttg tctgtttcag 3420
accctcttat gttatatttt tcttttcgtc ggtcagttga agccaatact ggtgtcctgg 3480
ccggcactgc aataccattt cgtttaatat aaagactctg ttatccgtga gctcgaattt 3540
ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 3600
tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 3660
atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 3720
atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 3780
atctatgtta ctagatcgc                                              3799
<210>15
<211>785
<212>DNA
<213>Flaveria trinervia
<400>15
ctcgagttgg taaggaaata attattttct tttttccttt tagtataaaa tagttaagtg   60
atgttaatta gtatgattat aataatatag ttgttataat tgtgaaaaaa taatttataa  120
atatattgtt tacataaaca acatagtaat gtaaaaaaat atgacaagtg atgtgtaaga  180
cgaagaagat aaaagttgag agtaagtata ttatttttaa tgaatttgat cgaacatgta  240
agatgatata ctagcattaa tatttgtttt aatcataata gtaattctag ctggtttgat  300
gaattaaata tcaatgataa aatactatag taaaaataag aataaataaa ttaaaataat  360
atttttttat gattaatagt ttattatata attaaatatc tataccatta ctaaatattt  420
tagtttaaaa gttaataaat attttgttag aaattccaat ctgcttgtaa tttatcaata  480
aacaaaatat taaataacaa gctaaagtaa caaataatat caaactaata gaaacagtaa  540
tctaatgtaa caaaacataa tctaatgcta atataacaaa gcgcaagatc tatcatttta  600
tatagtatta ttttcaatca acattcttat taatttctaa ataatacttg tagttttatt  660
aacttctaaa tggattgact attaattaaa tgaattagtc gaacatgaat aaacaaggta  720
acatgataga tcatgtcatt gtgttatcat tgatcttaca tttggattga ttacagttgc  780
tcgag                                                              785
<210>16
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>16
ctcgagttgg taaggaaata attattttct ttttt                             35
<210>17
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>17
ctcgagcaac tgtaatcaat ccaaatgtaa gatc                              34
<210>18
<211>334
<212>DNA
<213>辐射松
<400>18
attcaattct tcccactgca ggctacattt gtcagacacg ttttccgcca tttttcgcct   60
gtttctgcgg agaatttgat caggttcgga ttgggattga atcaattgaa aggtttttat  120
tttcagtatt tcgatcgcca tggccaacgg aatcaagaag gtcgagcatc tgtacagatc  180
gaagcttccc gatatcgaga tctccgacca tctgcctctt cattcgtatt gctttgagag  240
agtagcggaa ttcgcagaca gaccctgtct gatcgatggg gcgacagaca gaacttattg  300
cttttcagag gtggaactga tttctcgcaa ggtc                              334
<210>19
<211>334
<212>DNA
<213>辐射松
<400>19
gctgccggtc tggcgaagct cgggttgcag caggggcagg ttgtcatgct tctccttccg   60
aattgcatcg aatttgcgtt tgtgttcatg ggggcctctg tccggggcgc cattgtgacc  120
acggccaatc ctttctacaa gccgggcgag atcgccaaac aggccaaggc cgcgggcgcg  180
cgcatcatag ttaccctggc agcttatgtt gagaaactgg ccgatctgca gagccacgat  240
gtgctcgtca tcacaatcga tgatgctccc aaggaaggtt gccaacatat ttccgttctg  300
accgaagccg acgaaaccca atgcccggcc gtga                              334
<210>20
<211>334
<212>DNA
<213>辐射松
<400>20
caatccaccc ggacgatgtc gtggcgttgc cctattcttc cggaaccacg gggctcccca   60
agggcgtgat gttaacgcac aaaggcctgg tgtccagcgt tgcccagcag gtcgatggtg  120
aaaatcccaa tctgtatttc cattccgatg acgtgatact ctgtgtcttg cctcttttcc  180
acatctattc tctcaattcg gttctcctct gcgcgctcag agccggggct gcgaccctga  240
ttatgcagaa attcaacctc acgacctgtc tggagctgat tcagaaatac aaggttaccg  300
ttgccccaat tgtgcctcca attgtcctgg acat                              334
<210>21
<211>334
<212>DNA
<213>辐射松
<400>21
cacaaagagc cccatcgttt cccagtacga tgtctcgtcc gtccggataa tcatgtccgg   60
cgctgcgcct ctcgggaagg aactcgaaga tgccctcaga gagcgttttc ccaaggccat  120
tttcgggcag ggctacggca tgacagaagc aggcccggtg ctggcaatga acctagcctt  180
cgcaaagaat cctttccccg tcaaatctgg ctcctgcgga acagtcgtcc ggaacgctca  240
aataaagatc ctcgatacag aaactggcga gtctctcccg cacaatcaag ccggcgaaat  300
ctgcatccgc ggacccgaaa taatgaaagg atat                              334
<210>22
<211>334
<212>DNA
<213>辐射松
<400>22
attaacgacc cggaatccac ggccgctaca atcgatgaag aaggctggct ccacacaggc   60
gacgtcgggt acattgacga tgacgaagaa atcttcatag tcgacagagt aaaggagatt  120
atcaaatata agggcttcca ggtggctcct gctgagctgg aagctttact tgttgctcat  180
ccgtcaatcg ctgacgcagc agtcgttcct caaaagcacg aggaggcggg cgaggttccg  240
gtggcgttcg tggtgaagtc gtcggaaatc agcgagcagg aaatcaagga attcgtggca  300
aagcaggtga ttttctacaa gaaaatacac agag                              334
<210>23
<211>327
<212>DNA
<213>辐射松
<400>23
tttactttgt ggatgcgatt cctaagtcgc cgtccggcaa gattctgaga aaggatttga   60
gaagcagact ggcagcaaaa tgaaaatgaa tttccatatg attctaagat tcctttgccg  120
ataattatag gattcctttc tgttcacttc tatttatata ataaagtggt gcagagtaag  180
cgccctataa ggagagagag agcttatcaa ttgtatcata tggattgtca acgccctaca  240
ctcttgcgat cgctttcaat atgcatatta ctataaacga tatatgtttt ttttataaat  300
ttactgcact tctcgttcaa aaaaaaa                                      327
<210>24
<211>315
<212>DNA
<213>辐射松
<400>24
ccttcgcaaa gaatcctttc cccgtcaaat ctggctcctg cggaacagtc gtccggaacg  60
ctcaaataaa gatcctcgat acagaaactg gcgagtctct cccgcacaat caagccggcg 120
aaatctgcat ccgcggaccc gaaataatga aaggatatat taacgacccg gaatccacgg 180
ccgctacaat cgatgaagaa ggctggctcc acacaggcga cgtcgggtac attgacgatg 240
acgaagaaat cttcatagtc gacagagtaa aggagattat caaatataag ggcttccagg 300
tggctcctgc tgagc                                                  315
<210>25
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>25
aatcgatact gcaggcgcca ccaccaaacg ctca                             34
<210>26
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>26
aatcgatact gcagactcgg agatgttctc gaag                              34
<210>27
<211>200
<212>DNA
<213>巨桉
<400>27
gcgccaccac caaacgctca ccttctcatc atcagccctc tgtctctgtc tctgtctctc   60
gattctccgc cccgccacga caatggaggc gaagccgtcg gagcagcccc gcgagttcat  120
cttccggtcg aagctccccg acatctacat tcccgacaac ctctccctcc acgcctactg  180
cttcgagaac atctccgagt                                              200
<210>28
<211>223
<212>DNA
<213>巨桉
<400>28
tcgccgaccg cccctgcgtc atcaacgggg ccaccggccg gacctacacc tatgccgagg   60
tcgagctgat ctcccgccgg gtctcagccg gcctcaacgg gctcggcgtc ggacagggcg  120
acgtgatcat gctgctcctc cagaactgcc ctgagttcgt gttcgcgttc ctcggcgcgt  180
cctaccgggg cgccatcagc acgaccgcga acccgttcta cac                    223
<210>29
<211>300
<212>DNA
<213>巨桉
<400>29
gcgccggagg gctgcctgca cttctcggaa ttgatgcagg cggacgagaa cgccgccccc   60
gcggcggacg tcaagccgga cgacgtcttg gcgctcccct attcgtcggg cacgacgggg  120
cttcccaagg gagtgatgct tacgcacagg ggtcaagtga ccagcgtggc gcagcaggtc  180
gacggagaca accccaactt gtacttccac aaggaggacg tgatcctgtg cacgctcccg  240
ttgttccaca tatactccct caactcggtg atgttctgcg cgctccgtgt cggcgccgcc  300
<210>30
<211>348
<212>DNA
<213>巨桉
<400>30
gagctcgagg acaccgtgcg agccaagctg cccaatgcca agctcggaca gggctatggg  60
atgacggagg cgggcccggt gctggcaatg tgcccggcat ttgcaaagga gccgttcgag 120
atcaagtcag gcgcatgcgg gaccgtcgtg aggaacgcgg agatgaagat cgtcgacccg 180
gagacagggg cctcgctccc gcggaaccag gccggcgaga tctgcatccg gggtcaccag 240
atcatgaaag gttatctgaa cgacgccgag gcgaccgcaa ataccataga caaagaaggg 300
tggctgcaca ccggcgacat cggctacata gacgatgacg acgagctc              348
<210>31
<211>500
<212>DNA
<213>巨桉
<400>31
ttcctgttgc attcgtggtg aaatccaatg gttccgtaat caccgaggac gaaatcaagc   60
aatacatctc gaagcaggtc gtgttttaca agaggatcaa gcgggttttc ttcacggacg  120
caattccgaa agccccctcc ggaaaaatct tgaggaagga cctaagagca aagttggcct  180
ctggtgttta caattaattt ctcataccct tttctttttc aaccctgccc ctgtacttgc  240
ttaaagaccc atgtagttga aatgaatgta acctcttcgg aggggccaaa tatggaaggg  300
ggaaagaaag acatatggcg atgatttgat ttcacatgct attgtaatgt atttattgtt  360
tcaattccga attagacaaa gtgcttaaag ctctcttttc ggattttttt tttcattaat  420
gtataataat tgcggacatt acaatatact gtacaacgtg atttgagctt gatgaattac  480
aagattggaa gaacttcgaa                                              500
<210>32
<211>3844
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成核苷酸构建体
<400>32
ggccgcaaaa cccctcacaa atacataaaa aaaattcttt atttaattat caaactctcc   60
actacctttc ccaccaaccg ttacaatcct gaatgttgga aaaaactaac tacattgata  120
taaaaaaact acattacttc ctaaatcata tcaaaattgt ataaatatat ccactcaaag  180
gagtctagaa gatccacttg gacaaattgc ccatagttgg aaagatgttc accaagtcaa   240
caagatttat caatggaaaa atccatctac caaacttact ttcaagaaaa tccaaggatt   300
atagagtaaa aaatctatgt attattaagt caaaaagaaa accaaagtga acaaatattg   360
atgtacaagt ttgagaggat aagacattgg aatcgtctaa ccaggaggcg gaggaattcc   420
ctagacagtt aaaagtggcc ggaatcccgg taaaaaagat taaaattttt ttgtagaggg   480
agtgcttgaa tcatgttttt tatgatggaa atagattcag caccatcaaa aacattcagg   540
acacctaaaa ttttgaagtt taacaaaaat aacttggatc tacaaaaatc cgtatcggat   600
tttctctaaa tataactaga attttcataa ctttcaaagc aactcctccc ctaaccgtaa   660
aacttttcct acttcaccgt taattacatt ccttaagagt agataaagaa ataaagtaaa   720
taaaagtatt cacaaaccaa caatttattt cttttattta cttaaaaaaa caaaaagttt   780
atttatttta cttaaatggc ataatgacat atcggagatc cctcgaacga gaatctttta   840
tctccctggt tttgtattaa aaagtaattt attgtggggt ccacgcggag ttggaatcct   900
acagacgcgc tttacatacg tctcgagaag cgtgacggat gtgcgaccgg atgaccctgt   960
ataacccacc gacacagcca gcgcacagta tacacgtgtc atttctctat tggaaaatgt  1020
cgttgttatc cccgctggta cgcaaccacc gatggtgaca ggtcgtctgt tgtcgtgtcg  1080
cgtagcggga gaagggtctc atccaacgct attaaatact cgccttcacc gcgttacttc  1140
tcatcttttc tcttgcgttg tataatcagt gcgatattct cagagagctt ttcattcaaa  1200
ggtatggagt tttgaagggc tttactctta acatttgttt ttctttgtaa attgttaatg  1260
gtggtttctg tgggggaaga atcttttgcc aggtcctttt gggtttcgca tgtttatttg  1320
ggttattttt ctcgactatg gctgacatta ctagggcttt cgtgctttca tctgtgtttt  1380
cttcccttaa taggtctgtc tctctggaat atttaatttt cgtatgtaag ttatgagtag  1440
tcgctgtttg taataggctc ttgtctgtaa aggtttcagc aggtgtttgc gttttattgc  1500
gtcatgtgtt tcagaaggcc tttgcagatt attgcgttgt actttaatat tttgtctcca  1560
accttgttat agtttccctc ctttgatctc acaggaaccc tttcttcttt gagcattttc  1620
ttgtggcgtt ctgtagtaat attttaattt tgggcccggg ttctgagggt aggtgattat  1680
tcacagtgat gtgctttccc tataaggtcc tctatgtgta agctgttagg gtttgtgcgt  1740
tactattgac atgtcacatg tcacatattt tcttcctctt atccttcgaa ctgatggttc  1800
tttttctaat tcgtggattg ctggtgccat attttatttc tattgcaact gtattttagg  1860
gtgtctcttt ctttttgatt tcttgttaat atttgtgttc aggttgtaac tatgggttgc  1920
tagggtgtct gccctcttct tttgtgcttc tttcgcagaa tctgtccgtt ggtctgtatt  1980
tgggtgatga attatttatt ccttgaagta tctgtctaat tagcttgtga tgatgtgcag  2040
gtatattcgt tagtcatatt tcaatttcaa gcgatccccc gggctgcagg cgccaccacc  2100
aaacgctcac cttctcatca tcagccctct gtctctgtct ctgtctctcg attctccgcc  2160
ccgccacgac aatggaggcg aagccgtcgg agcagccccg cgagttcatc ttccggtcga  2220
agctccccga catctacatt cccgacaacc tctccctcca cgcctactgc ttcgagaaca  2280
tctccgagtc tgcaggaatt cgtccagcag taattcgatt ctcgagttgg taaggaaata  2340
attattttct tttttccttt tagtataaaa tagttaagtg atgttaatta gtatgattat  2400
aataatatag ttgttataat tgtgaaaaaa taatttataa atatattgtt tacataaaca  2460
acatagtaat gtaaaaaaat atgacaagtg atgtgtaaga cgaagaagat aaaagttgag  2520
agtaagtata ttatttttaa tgaatttgat cgaacatgta agatgatata ctagcattaa  2580
tatttgtttt aatcataata gtaattctag ctggtttgat gaattaaata tcaatgataa  2640
aatactatag taaaaataag aataaataaa ttaaaataat atttttttat gattaatagt  2700
ttattatata attaaatatc tataccatta ctaaatattt tagtttaaaa gttaataaat  2760
attttgttag aaattccaat ctgcttgtaa tttatcaata aacaaaatat taaataacaa  2820
gctaaagtaa caaataatat caaactaata gaaacagtaa tctaatgtaa caaaacataa  2880
tctaatgcta atataacaaa gcgcaagatc tatcatttta tatagtatta ttttcaatca  2940
acattcttat taatttctaa ataatacttg tagttttatt aacttctaaa tggattgact  3000
attaattaaa tgaattagtc gaacatgaat aaacaaggta acatgataga tcatgtcatt  3060
gtgttatcat tgatcttaca tttggattga ttacagttgc tcgagaatca ctagtgaatt  3120
aaatctggaa gcttatcgat actgcagact cggagatgtt ctcgaagcag taggcgtgga  3180
gggagaggtt gtcgggaatg tagatgtcgg ggagcttcga ccggaagatg aactcgcggg  3240
gctgctccga cggcttcgcc tccattgtcg tggcggggcg gagaatcgag agacagagac  3300
agagacagag ggctgatgat gagaaggtga gcgtttggtg gtggcgcctg cagtatcgat  3360
gggtgttatt tgtggataat aaattcgggt gatgttcagt gtttgtcgta tttctcacga  3420
ataaattgtg tttatgtatg tgttagtgtt gtttgtctgt ttcagaccct cttatgttat  3480
atttttcttt tcgtcggtca gttgaagcca atactggtgt cctggccggc actgcaatac  3540
catttcgttt aatataaaga ctctgttatc cgtgagctcg aatttccccg atcgttcaaa  3600
catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat  3660
ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 3720
tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 3780
caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 3840
tcgc                                                              3844
<210>33
<211>200
<212>DNA
<213>巨桉
<400>33
atttgatttc acatgctatt gtaatgtatt tattgtttca attccgaatt agacaaagtg   60
cttaaagctc tcttttcgga tttttttttt cattaatgta taataattgc ggacattaca  120
atatactgta caacgtgatt tgagcttgat gaattacaag attggaagaa cttcgaagac  180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                              200
<210>34
<211>600
<212>DNA
<213>巨桉
<400>34
gcgccaccac caaacgctca ccttctcatc atcagccctc tgtctctgtc tctgtctctc  60
gattctccgc cccgccacga caatggaggc gaagccgtcg gagcagcccc gcgagttcat 120
cttccggtcg aagctccccg acatctacat tcccgacaac ctctccctcc acgcctactg 180
cttcgagaac atctccgagt tcgccgaccg cccctgcgtc atcaacgggg ccaccggccg 240
gacctacacc tatgccgagg tcgagctgat ctcccgccgg gtctcagccg gcctcaacgg 300
gctcggcgtc ggacagggcg acgtgatcat gctgctcctc cagaactgcc ctgagttcgt 360
gttcgcgttc ctcggcgcgt cctaccgggg cgccatcagc acgaccgcga acccgttcta 420
caccccgggc gagatcgcca agcaggcctc agctgcccgg gccaagatcg tgatcacgca 480
ggccgcgttc gccgacaagg tgaggccgtt cgcggaggag aacggggtga aggtcgtgtg 540
catcgatacc gcgccggagg gctgcctgca cttctcggaa ttgatgcagg cggacgagaa 600
<210>35
<211>2435
<212>DNA
<213>巨桉
<400>35
aaatacatgc cagtgtggaa taactatgcg aagttatcat ttggtgcact tgcttgggtg   60
aacttgatgc cttactgaag ttttattttt gaccatcttt gttgtgattt aacatatttg  120
agcgctaccg tacttatgac acttaaatga tgaaagttgc tgtagggtga atttggctgt  180
ttgacgcatg gagattaggc attaaccttt cttagttatg ctgattattt cttgtgtgtc  240
tttttttccc cctccttcag catcacttgt ttgcaagtgg aagagatatg actttctttc  300
aggtacttgt tttcataccc atattaatac atctggttaa atcatgaaat ttttgtattg  360
atcgtttgta tgtccaatga cagtatgacc tattcaatga catttggttg tgtgctagat  420
ttcgttccag agaaaatgaa agcagaagat gcattggcag agaggaaacc agaagagaca  480
tgaatatgat actaatctta ggtcaagaag ctgtaacttt cattgattga ggggcttcaa  540
tttgtatgag catcttatac tgtgatttgg ttcttttcct gctatagcag aatagagcca  600
gcaaaatggg cacttacatt tagctgcaga tgatgtctgt atgggcgaat tttttcgcat  660
gttacattgg agaagagaaa tgcttatact tctggtaatt ttttcagcaa atagtctcat  720
gccctgctaa catggatggt gggatagctt cttctgggga gtgtaattaa tctgtcatgg  780
acaagtactt tgtagttaat ctgattctcg gcctatgtta tatctgtttt gcgttatact  840
aaagatattc agatcaatct atgtcaatct attcacgaaa acccggggag tctaatgagg  900
agagttgcat cttggcaata tagtttttaa gaatggatat ccagatccct acgaactgga  960
ttcacacagt cactgctgta agctctggtt ttttttagct taggaagcag gttataatca  1020
aagatgatta aaccatcgcg tgttcgccag ccatcagaaa tggaaaggca aatgttgtta  1080
tagtgatgga cagatcatgc tgagatgatt gattatgaat cttactgatg actgtcattt  1140
atgttatcgc actctgtgtg tgtgggtgtg tgtaatgagt aatatcaaat taaccagacg  1200
ataggtgttg aagattagct gttgggccgc cgtggcaaaa ggtgtcttat acaagccatc  1260
ggcagtgacg cagaactgta gagaaccgct gtaacaagtc ttcgaatgca ttcttttaat  1320
gtacagcacg acatgaaggg ggttcaagtg tagcgaacag ttcgtgcgag aaagatcatt  1380
ttcaatagca taaaagagtc tgctctctgc tgcaaacatg gaaagaactt acatttcaat  1440
cattgaggag aagattataa caaatcctaa atggttggga ttttagttag tccattcgaa  1500
ctaaagtggc gaagatgtca gtttttcaag tggatgatat ttctcatgta tgttccgcag  1560
aggcaatcac cttgtttgta actagacatc tagagaacct aacaaggatt gatgggggtg  1620
aggtgaaatg tctgtttcct ctttaatatg gatccagcga tgccttacag agcggatgga  1680
tggcactggc aagtcttaat ccttaggtcg aatgtttgat tggtaacaga tgccttttct  1740
ttcttttcaa tcacagctga caaatgcaaa tatctaaaac cattggctgt ttggtgcttg  1800
caagtctgga ttaccccact ttatgtttca cctttcaata atgaataaca aggtactcgg  1860
gaaaaaaagg aaagggaaat tcgcacaacc aaagttgcta tgcagaagtc aactcaatcc  1920
taatcaagtt gatgagagtg ttgggcccta ttttctgcag caaacatgaa tctcgattca  1980
tctccctcgc aaaagataag gaagctgcaa aagctttcct cctaagtttg ttggcaggca  2040
aattgatttt gtaccagaaa taaatacaaa gtgaaaccca agcaatcacg catggcctga  2100
tttgtgccat gtccatttga tctccctcta ccatttttcc tgctttctca agcaaactag  2160
ttgctgtaac agtgaatgat cccccggctc tctctctctc tctctctctc tccatttatt  2220
ccatccatgt ttttgctttt cgcacaacac ttatcattga ggtgctaact actgaattcc  2280
cctaactaaa aattggaacc tctcacctaa tttcattttc tcccactttg atgagcacca  2340
ctctctttcc cagatttcaa ataaattgcc actctctccc tcctctttcc tcacacaacc  2400
aaaagccttc ttcaagtacc acttcttcac tgtcc                             2435
<210>36
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>36
gagagaggat ccggtgtgaa ataccgcaca g                                   31
<210>37
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>37
gagagatgat cagcctcact gattaagcat tggtaactg                           39
<210>38
<211>390
<212>DNA
<213>辐射松
gtagatttaa atgctttttt gaaatccggt tactcgcaag attatcaatc gggactgtag   60
ccgaagcttt gagaggttga aattcagact tttgctccga actgttctgc tgaaacaaaa  120
tccagtattg agctaggttt agaatcgggt ttgctggtca tctgggagag gcgatccatt  180
cagcttcgca ggcccccgaa gatggcgttc gccggcacaa cccagaagtg caaggcatgt  240
gaaaagacgg tctatttggt tgatcaattg acagctgata attctgtttt tcacaaatcc  300
tgtttccgct gccatcactg caatggaact ttaaagctta gcaactattc gtcgtttgag  360
ggagttctat attgcaaacc tcattttgac                                   390
<210>39
<211>390
<212>DNA
<213>辐射松
<400>39
cagctgttta agagaacagg aagtttggat aaaagttttg aagccattcc tagagcatca   60
agaaatgaca agatgcatga gaatgagaac aggacaccta gtagggtatc agcattgttt  120
tccggtacac aggataaatg tgttgcatgt gggaagacag tgtaccccat tgagaaggtt  180
gctgttgatg gtacatcata ccaccgacca tgcttcaagt gctgtcatgg tggttgtgtc  240
atcagcccct caaattatgt tgctcatgaa ggcaggctat attgtaggca tcatagctct  300
caacttttta gggagaaagg taacttcagc cagctttcaa aggcaacacc tacaaaaggg  360
gtgactgaga actcagacac agacgacaag                                   390
<210>40
<211>164
<212>DNA
<213>巨桉
<400>40
ggcttccctt tcttatcctc cattctcctc tctccttctc cttacactca cagacacaat   60
cacagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gaatggcatt cgcaggaaca  120
acccagaagt gcatggcctg tgagaagaca gtctatctgg tgga                   164
<210>41
<211>455
<212>DNA
<213>巨桉
<400>41
ggcttccctt tcttatcctc cattctcctc tctccttctc cttacactca cagacacaat   60
cacagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gaatggcatt cgcaggaaca  120
acccagaagt gcatggcctg tgagaagaca gtctatctgg tggacaagct cacagctgac  180
aatagaatct accacaaggc ctgcttcaga tgccaccatt gcaaagggac tctcaagctt  240
gggaactata attcatttga aggagtcttg tactgccggc cgcatttcga tcagctcttc  300
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cgagacaaat gtgtaggctg taagagcacc gtcta                             455
<210>42
<211>551
<212>DNA
<213>辐射松
<400>42
aggtttaagg aaatggcagg cacaagtgtt gctgcagcag aggtgaaggc tcagacaacc  60
caagcagagg agccggttaa ggttgtccgc catcaagaag tgggacacaa aagtcttttg 120
cagagcgatg ccctctatca gtatatattg gaaacgagcg tgtaccctcg tgagcccgag 180
ccaatgaagg agctccgcga agtgactgcc aagcatccct ggaacctcat gactacttct 240
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<210>43
<211>225
<212>DNA
<213>辐射松
<400>43
gaaggaattt ggtaggcaac tatgtatatc actatattat atgcattttc tcgagatgtc   60
taatctcatt tgtgtcccac ctccctggac cggctaatga tttgactatc tttgttttaa  120
aggaagcaaa cttggtgtag gattctctcc aacttcaatg atgcaataag caagaggata  180
aatgtcatta tctttcatgg acggagcaca aatggctttt tacac                  225
<210>44
<211>161
<212>DNA
<213>巨桉
<400>44
tcgcaccaga aaggagatct caaaatcaag cattgatgaa atgagaaact acccttaata   60
ctttccttcc tttctatttt ttccatcttc tgtcttatgt tgtctttgaa ccattgagca  120
tgtatttgta ttcaaatgaa cgattaagga ttgagaagaa c                      161
<210>45
<211>289
<212>DNA
<213>巨桉
<400>45
caccccggtg aagcagtgcc tgtacgaaac tgtcaagagc ttgcaggaga aaggccacct   60
acccgtccct cccccgccgg aagattcggt gcgtattcag ggatgatctt agatccatca  120
cggtgcgcat ttgtaatccg gagaaatgag agaaacatgt gggaatttgt ttgtactttt  180
ctaagtcaaa cctggagata ccaaccctga gttctgcatt ggaatggaag ttgtcaattg  240
atcaatcgtc gcaagttatc gttggcagaa acggaatgtc agttaccat              289
<210>46
<211>601
<212>DNA
<213>巨桉
<400>46
gaagcttggc gcatcgctcg ccatggcgga gcacatcccg tggcttcgct ggatgttccc   60
gctggaggag gaagcgttcg ccaagcacag cgcgaggagg gaccgcctca cccgggccat  120
catggaggag cacacggtag cccgccagaa gagcggggcc aagcagcatt tcgtcgacgc  180
cctgctcacc ctcaaggaca aatacgacct cagcgaagat accatcatag gactcctctg 240
ggacatgatc acagcaggca tggacactac tgctatttca gtggagtggg cgatggcgga 300
gctgatcaag aacccgaggg tgcaacagaa ggcccaagag gagctcgacc gggtcgtcgg 360
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ccacgtcaag atcggcggct acgacatccc caaggggtcg aacgtccacg tgaatgtatg 540
ggccatcgcc cgcgacccgg ccgtctggaa tagcccgctc gagttcaggc ccgagcggtt 600
c                                                                 601
<210>47
<211>602
<212>DNA
<213>巨桉
<400>47
ccctgaggct ccggatggcg atcccgctcc tcgtgcccca catgaacctc cacgacgcca  60
agctcggggg ctacgacatc cccgccgaga gcaagatcct ggtcaacgcg tggtggctgg 120
ccaacaaccc tgcccactgg aagaagcccg aggagttccg gcccgagcgg ttcctggagg 180
aggaggcgaa ggtcgaggcc aacgggaacg acttccggta cctccccttc ggagtcggcc 240
ggaggagctg ccctgggatc atcctggccc tgcccatcct cggggtcacc atcggccagt 300
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agtattaaaa tatgaagaat tggacaaagc atattcagga gttgccatga gaacttatgt 540
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tg                                                                602
<210>48
<211>668
<212>DNA
<213>辐射松
<400>48
attcaattct tcccactgca ggctacattt gtcagacacg ttttccgcca tttttcgcct  60
gtttctgcgg agaatttgat caggttcgga ttgggattga atcaattgaa aggtttttat 120
tttcagtatt tcgatcgcca tggccaacgg aatcaagaag gtcgagcatc tgtacagatc 180
gaagcttccc gatatcgaga tctccgacca tctgcctctt cattcgtatt gctttgagag 240
agtagcggaa ttcgcagaca gaccctgtct gatcgatggg gcgacagaca gaacttattg 300
cttttcagag gtggaactga tttctcgcaa ggtcgctgcc ggtctggcga agctcgggtt 360
gcagcagggg caggttgtca tgcttctcct tccgaattgc atcgaatttg cgtttgtgtt 420
catgggggcc tctgtccggg gcgccattgt gaccacggcc aatcctttct acaagccggg 480
cgagatcgcc aaacaggcca aggccgcggg cgcgcgcatc atagttaccc tggcagctta 540
tgttgagaaa ctggccgatc tgcagagcca cgatgtgctc gtcatcacaa tcgatgatgc 600
tcccaaggaa ggttgccaac atatttccgt tctgaccgaa gccgacgaaa cccaatgccc 660
ggccgtga                                                          668
<210>49
<211>6629
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成核苷酸构建体
<400>49
cgccggcgtt gtggatacct cgcggaaaac ttggccctca ctgacagatg aggggcggac    60
gttgacactt gaggggccga ctcacccggc gcggcgttga cagatgaggg gcaggctcga   120
tttcggccgg cgacgtggag ctggccagcc tcgcaaatcg gcgaaaacgc ctgattttac   180
gcgagtttcc cacagatgat gtggacaagc ctggggataa gtgccctgcg gtattgacac   240
ttgaggggcg cgactactga cagatgaggg gcgcgatcct tgacacttga ggggcagagt   300
gctgacagat gaggggcgca cctattgaca tttgaggggc tgtccacagg cagaaaatcc   360
agcatttgca agggtttccg cccgtttttc ggccaccgct aacctgtctt ttaacctgct   420
tttaaaccaa tatttataaa ccttgttttt aaccagggct gcgccctgtg cgcgtgaccg   480
cgcacgccga aggggggtgc ccccccttct cgaaccctcc cggcccgcta acgcgggcct   540
cccatccccc caggggctgc gcccctcggc cgcgaacggc ctcaccccaa aaatggcagc   600
gctggcagtc cataattgtg gtttcaaaat cggctccgtc gatactatgt tatacgccaa   660
ctttgaaaac aactttgaaa aagctgtttt ctggtattta aggttttaga atgcaaggaa   720
cagtgaattg gagttcgtct tgttataatt agcttcttgg ggtatcttta aatactgtag   780
aaaagaggaa ggaaataata aatggctaaa atgagaatat caccggaatt gaaaaaactg   840
atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt ctcctgctaa ggtatataag   900
ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg acagccggta taaagggacc   960
acctatgatg tggaacggga aaaggacatg atgctatggc tggaaggaaa gctgcctgtt  1020
ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca atctgctcat gagtgaggcc  1080
gatggcgtcc tttgctcgga agagtatgaa gatgaacaaa gccctgaaaa gattatcgag  1140
ctgtatgcgg agtgcatcag gctctttcac tccatcgaca tatcggattg tccctatacg  1200
aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac tgaataacga tctggccgat  1260
gtggattgcg aaaactggga agaagacact ccatttaaag atccgcgcga gctgtatgat  1320
tttttaaaga cggaaaagcc cgaagaggaa cttgtctttt cccacggcga cctgggagac  1380
agcaacatct ttgtgaaaga tggcaaagta agtggcttta ttgatcttgg gagaagcggc  1440
agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt cgatcaggga ggatatcggg  1500
gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga tcaagcctga ttgggagaaa  1560
ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagtacc tagatgtggc gcaacgatgc  1620
cggcgacaag caggagcgca ccgacttctt ccgcatcaag tgttttggct ctcaggccga  1680
ggcccacggc aagtatttgg gcaaggggtc gctggtattc gtgcagggca agattcggaa  1740
taccaagtac gagaaggacg gccagacggt ctacgggacc gacttcattg ccgataaggt  1800
ggattatctg gacaccaagg caccaggcgg gtcaaatcag gaataagggc acattgcccc  1860
ggcgtgagtc ggggcaatcc cgcaaggagg gtgaatgaat cggacgtttg accggaaggc  1920
atacaggcaa gaactgatcg acgcggggtt ttccgccgag gatgccgaaa ccatcgcaag  1980
ccgcaccgtc atgcgtgcgc cccgcgaaac cttccagtcc gtcggctcga tggtccagca  2040
agctacggcc aagatcgagc gcgacagcgt gcaactggct ccccctgccc tgcccgcgcc  2100
atcggccgcc gtggagcgtt cgcgtcgtct cgaacaggag gcggcaggtt tggcgaagtc  2160
gatgaccatc gacacgcgag gaactatgac gaccaagaag cgaaaaaccg ccggcgagga  2220
cctggcaaaa caggtcagcg aggccaagca ggccgcgttg ctgaaacaca cgaagcagca  2280
gatcaaggaa atgcagcttt ccttgttcga tattgcgccg tggccggaca cgatgcgagc  2340
gatgccaaac gacacggccc gctctgccct gttcaccacg cgcaacaaga aaatcccgcg  2400
cgaggcgctg caaaacaagg tcattttcca cgtcaacaag gacgtgaaga tcacctacac  2460
cggcgtcgag ctgcgggccg acgatgacga actggtgtgg cagcaggtgt tggagtacgc  2520
gaagcgcacc cctatcggcg agccgatcac cttcacgttc tacgagcttt gccaggacct  2580
gggctggtcg atcaatggcc ggtattacac gaaggccgag gaatgcctgt cgcgcctaca  2640
ggcgacggcg atgggcttca cgtccgaccg cgttgggcac ctggaatcgg tgtcgctgct  2700
gcaccgcttc cgcgtcctgg accgtggcaa gaaaacgtcc cgttgccagg tcctgatcga  2760
cgaggaaatc gtcgtgctgt ttgctggcga ccactacacg aaattcatat gggagaagta  2820
ccgcaagctg tcgccgacgg cccgacggat gttcgactat ttcagctcgc accgggagcc  2880
gtacccgctc aagctggaaa ccttccgcct catgtgcgga tcggattcca cccgcgtgaa  2940
gaagtggcgc gagcaggtcg gcgaagcctg cgaagagttg cgaggcagcg gcctggtgga  3000
acacgcctgg gtcaatgatg acctggtgca ttgcaaacgc tagggccttg tggggtcagt  3060
tccggctggg ggttcagcag ccagcgcttt actggcattt caggaacaag cgggcactgc  3120
tcgacgcact tgcttcgctc agtatcgctc gggacgcacg gcgcgctcta cgaactgccg  3180
atagacaact gtcacggtta agcgagaaat gaataagaag gctgataatt cggatctctg  3240
cgagggagat gatatttgat cacaggcagc aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc  3300
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agcatcggta acatgagcaa agtctgccgc cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc  3420
cggactgatg ggctgcctgt atcgagtggt gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc 3480
tgttggctgg ctggtggcag gatatattgt ggtgtaaaca aattgacgct tagacaactt 3540
aataacacac cgcggtctag aactagtgga tcccccctac gtgcgatcta gtaacataga 3600
tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt ctatcgcgta 3660
ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata acgtcatgca 3720
ttacatgtta attattacat gcttaacgta attcaacaga aattatatga taatcatcgc 3780
aagaccggca acaggattca atcttaagaa actttattgc caaatgtttg aacgatccct 3840
cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata 3900
ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg 3960
gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat 4020
ccagaaaagc ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg 4080
acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg 4140
agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta 4200
cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc 4260
gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga 4320
gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca 4380
gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc 4440
gctgcctcgt cctggagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc 4500
gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt 4560
gcccagtcat agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca 4620
tcttgttcaa tcatagtact agttggggat ctgcatctga aataaaacaa tagaacaagt 4680
agaaaccaat cagcgaacat ataccaaatc aaaagccgta agagaaatca aaacaacacc 4740
aaagagaaac ggatctaaac ataagaaacc taaaacagag agaatcgaac aaagaaaaca 4800
caaaaattga atagatcgtc cttgaaaatc ctaatttcac aatcaagcaa gaaattacac 4860
agatgtaaac actacgaatc gatatcttag taatcaggac aaaatttaga agctggattg 4920
acgaaacgaa caatattgtc aaaagcaatt tatacaaaag attcaataat ccacataaca 4980
aaaattggag atcagatacg aatcaaaaac aaaaagaatc agaaaatata ccttgaaaga 5040
gagagtcgcg agagatttgc agagatcgct ttaggctttg ggagagattg aagagtcaga 5100
aaaagacgaa aggatgaatt attatcttcc acacgaaggt cttctttata tcgcaaacca 5160
aaagcccaaa accgtctttt ctattaatga gaataaaata tctttagcca aaacaaaaaa 5220
aggaagatat cagttgagga ttattatcac gaaactaaag gaaggaatca tatgatacgt 5280
gtctattttc caccgtgcgt ttttaaaaga ccgactcaag tagaaacatc ctatggtggt 5340
ggttggatta ggtcatccat tacatctgct tcactgacat ttttctattt ttctttttgt 5400
atatactttt cctcaaataa tttctttctt ttctatagaa gaatttaatc aataaggaaa 5460
aagttcaaaa aagattcttt ccattaagac tatgtcttgg ttaacccaac ccattaagaa 5520
taagcaatca taatatatat agagaatact aatactatat atgagatttt tcttttaatt 5580
tcatgttgat tatgatagtt tatcttcttg atttaattta tcaatacttg gcataaaaga 9640
ttctaatcta ctctaataaa gaaaagaaaa aaaagtatct accattgact aattaaaata 5700
aggaaactta tctaccaaat ttgagtattt tttagaacaa tctttttggt ttaattccaa 5760
aactctaaac ctaattgttg ggaaaaagga cctaattttt aagaaaagtt aataattaga 5820
agatctgtat gttttttttt ttgatccaag tttttatttc ttttctcttt ttttcatgat 5880
aaaatctatg tttttttagt ctacaattaa agtaattgtt attattttct ttatcttttt 5940
ttgttgttgt tgttaattcc cttttttttt ttttaacagc aacttcttaa aaaaaaaaac 6000
agttgggcct tgaatttatt tcaggcctgc gttattaagc ccagataata actcaaaaca 6060
aaaaaaatgt tgaaccggaa taaacccgcg agattaaatg ccggttttca ggtaacatag 6120
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agcttaaatt tctcctcact cttctgctac agactcggaa ctctttctct ttgctaaaat 6240
aagatgttca ggatttttgt tgcccgacaa ttcatgtatc tcacactctc tctcttctct 6300
gttcttacta ctctgttaca ttaccaccaa ctcaagactt tcttccacaa tggcgtttat 6360
gagacttggc tccaaatccg aagcttatcg ataccgtcga cctctagagg cgcgccaagc 6420
ggccgcattt aaatgggccc tcgagagccc gggctcctgc aggtacctta attaaaagtt 6480
taaactatca gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta 6540
ttagaataat cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg 6600
tgcatgccaa ccacagggtt ccccagatc                                   6629
<210>50
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>50
gagagaccat aattgtggtc caatttgcag ccgtccgag                           39
<210>51
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>51
gagagaccat aattgtggtt tgtgtttcca tattgttcat c                        41
<210>52
<211>1878
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成核苷酸构建体
<400>52
ggcgcgccgt caacggatca ggatatcctt gtttaagatg ttgaactcta tggaggtttg    60
tatgaactga tgatctagga ccggataagt tcccttcttc atagcgaact tattcaaaga   120
atgttttgtg tatcattctt gttacattgt tattaatgaa aaaatattat tggtcattgg   180
actgaacacg agtgttaaat atggaccagg ccccaaataa gatccattga tatatgaatt   240
aaataacaag aataaatcga gtcaccaaac cacttgcctt ttttaacgag acttgttcac   300
caacttgata caaaagtcat tatcctatgc aaatcaataa tcatacaaaa atatccaata   360
acactaaaaa attaaaagaa atggataatt tcacaatatg ttatacgata aagaagttac   420
ttttccaaga aattcactga ttttataagc ccacttgcat tagataaatg gcaaaaaaaa   480
acaaaaagga aaagaaataa agcacgaaga attctagaaa atacgaaata cgcttcaatg   540
cagtgggacc cacggttcaa ttattgccaa ttttcagctc caccgtatat ttaaaaaata   600
aaacgataat gctaaaaaaa tataaatcgt aacgatcgtt aaatctcaac ggctggatct   660
tatgacgacc gttagaaatt gtggttgtcg acgagtcagt aataaacggc gtcaaagtgg   720
ttgcagccgg cacacacgag tcgtgtttat caactcaaag cacaaatact tttcctcaac   780
ctaaaaataa ggcaattagc caaaaacaac tttgcgtgta aacaacgctc aatacacgtg   840
tcattttatt attagctatt gcttcaccgc cttagctttc tcgtgaccta gtcgtcctcg   900
tcttttcttc ttcttcttct ataaaacaat acccaaagag ctcttcttct tcacaattca   960
gatttcaatt tctcaaaatc ttaaaaactt tctctcaatt ctctctaccg tgatcaaggt  1020
aaatttctgt gttccttatt ctctcaaaat cttcgatttt gttttcgttc gatcccaatt  1080
tcgtatatgt tctttggttt agattctgtt aatcttagat cgaagacgat tttctgggtt  1140
tgatcgttag atatcatctt aattctcgat tagggtttca taaatatcat ccgatttgtt  1200
caaataattt gagttttgtc gaataattac tcttcgattt gtgatttcta tctagatctg  1260
gtgttagttt ctagtttgtg cgatcgaatt tgtcgattaa tctgagtttt tctgattaac  1320
agatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat  1380
tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt  1440
cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac 1500
tccaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg 1560
tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc 1620
aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa 1680
tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc 1740
gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag cgatcaggat gatctggacg aagagcatca 1800
ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga 1860
tctcgtcgtg acccatgg                                               1878
<210>53
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>53
gagaggcgcg ccgtcaacgg atcaggatat ccttgtttaa ga                42
<210>54
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>54
tgctggcaat ccatcttgtt caatcatctg ttaatcagaa aaactcagat ta    52
<210>55
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>55
taatctgagt ttttctgatt aacagatgat tgaacaagat ggattgcacg ca    52
<210>56
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>56
tattgccaaa tgtttgaacg atccctcaga  agaactcgtc aagaaggcga ta   52
<210>57
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>57
tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaggg atcgttcaaa catttggcaa ta    52
<210>58
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>58
gagacactac gtgcgatcta gtaacataga tgacac                      36
<210>59
<211>12290
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成寡核苷酸构建体
<400>59
cgccggcgtt gtggatacct cgcggaaaac ttggccctca ctgacagatg aggggcggac   60
gttgacactt gaggggccga ctcacccggc gcggcgttga cagatgaggg gcaggctcga  120
tttcggccgg cgacgtggag ctggccagcc tcgcaaatcg gcgaaaacgc ctgattttac  180
gcgagtttcc cacagatgat gtggacaagc ctggggataa gtgccctgcg gtattgacac  240
ttgaggggcg cgactactga cagatgaggg gcgcgatcct tgacacttga ggggcagagt  300
gctgacagat gaggggcgca cctattgaca tttgaggggc tgtccacagg cagaaaatcc  360
agcatttgca agggtttccg cccgtttttc ggccaccgct aacctgtctt ttaacctgct  420
tttaaaccaa tatttataaa ccttgttttt aaccagggct gcgccctgtg cgcgtgaccg  480
cgcacgccga aggggggtgc ccccccttct cgaaccctcc cggcccgcta acgcgggcct  540
cccatccccc caggggctgc gcccctcggc cgcgaacggc ctcaccccaa aaatggcagc  600
gctggcagtc cataattgtg gtccaatttg cagccgtccg agacaggagg acatcgtcca  660
gctgaaaccg gggcagaatc cggccatttc tgaagagaaa aatggtaaac tgatagaata  720
aaatcataag aaaggagccg cacatgaaaa aagcagtcat taacggggaa caaatcagaa  780
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aatggaggca gtttgaacaa agcaagcagc tgactgaaaa tggcgccgag agtgtgcttc  960
aggttttccg tgaagcgaaa gcggaaggct gcgacatcac catcatactt tcttaatacg 1020
atcaatggga gatgaacaat atggaaacac aaaccacaat tgtggtttca aaatcggctc 1080
cgtcgatact atgttatacg ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg ttttctggta  1140
tttaaggttt tagaatgcaa ggaacagtga attggagttc gtcttgttat aattagcttc  1200
ttggggtatc tttaaatact gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga  1260
atatcaccgg aattgaaaaa actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga tacggaagga  1320
atgtctcctg ctaaggtata taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata tttaaaaatg  1380
acggacagcc ggtataaagg gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga catgatgcta  1440
tggctggaag gaaagctgcc tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca tgatggctgg  1500
agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta tgaagatgaa  1560
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gacatatcgg attgtcccta tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga attggattac  1680
ttactgaata acgatctggc cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga cactccattt  1740
aaagatccgc gcgagctgta tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga ggaacttgtc  1800
ttttcccacg gcgacctggg agacagcaac atctttgtga aagatggcaa agtaagtggc  1860
tttattgatc ttgggagaag cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc cttctgcgtc  1920
cggtcgatca gggaggatat cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt tgacttactg  1980
gggatcaagc ctgattggga gaaaataaaa tattatattt tactggatga attgttttag  2040
tacctagatg tggcgcaacg atgccggcga caagcaggag cgcaccgact tcttccgcat  2100
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attcgtgcag ggcaagattc ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga cggtctacgg  2220
gaccgacttc attgccgata aggtggatta tctggacacc aaggcaccag gcgggtcaaa  2280
tcaggaataa gggcacattg ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag gagggtgaat  2340
gaatcggacg tttgaccgga aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg ggttttccgc  2400
cgaggatgcc gaaaccatcg caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg aaaccttcca  2460
gtccgtcggc tcgatggtcc agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca gcgtgcaact  2520
ggctccccct gccctgcccg cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc gtctcgaaca  2580
ggaggcggca ggtttggcga agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta tgacgaccaa  2640
gaagcgaaaa accgccggcg aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca agcaggccgc  2700
gttgctgaaa cacacgaagc agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt tcgatattgc  2760
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caaggacgtg aagatcacct acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg acgaactggt  2940
gtggcagcag gtgttggagt acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga tcaccttcac  3000
gttctacgag ctttgccagg acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt acacgaaggc  3060
cgaggaatgc ctgtcgcgcc tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg accgcgttgg  3120
gcacctggaa tcggtgtcgc tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg gcaagaaaac  3180
gtcccgttgc caggtcctga tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg gcgaccacta  3240
cacgaaattc atatgggaga agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac ggatgttcga  3300
ctatttcagc tcgcaccggg agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc gcctcatgtg  3360
cggatcggat tccacccgcg tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag cctgcgaaga  3420
gttgcgaggc agcggcctgg tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg tgcattgcaa  3480
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atttcaggaa caagcgggca ctgctcgacg cacttgcttc gctcagtatc gctcgggacg  3600
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tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata  3840
cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa  3900
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct  3960
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa  4020
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg  4080
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca  4140
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa  4200
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg  4260
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg  4320
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg  4380
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc  4440
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag  4500
attacgcgca gaaaaaaagg atatcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac  4560
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc  4620
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag  4680
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tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg  4800
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tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt  4980
aaacaaattg acgcttagac aacttaataa cacaccgcgg tctagaacta gtggatcccc  5040
cctacgtgcg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc  5100
gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa  5160
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acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt  5280
attcccaaat gtttgaacga tccctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat  5340
gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc  5400
gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac  5460
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caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag  5580
cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc  5640
gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc  5700
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caaatcgaag agtaattatt cgacaaaact caaattattt gaacaaatcg gatgatattt  6240
atgaaaccct aatcgagaat taagatgata tctaacgatc aaacccagaa aatcgtcttc  6300
gatctaagat taacagaatc taaaccaaag aacatatacg aaattgggat cgaacgaaaa  6360
caaaatcgaa gattttgaga gaataaggaa cacagaaatt taccttgatc acggtagaga  6420
gaattgagag aaagttttta agattttgag aaattgaaat ctgaattgtg aagaagaaga  6480
gctctttggg tattgtttta tagaagaaga agaagaaaag acgaggacga ctaggtcacg  6540
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ttacacgcaa agttgttttt ggctaattgc cttattttta ggttgaggaa aagtatttgt  6660
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ggagctgaaa attggcaata attgaaccgt gggtcccact gcattgaagc gtatttcgta  6900
ttttctagaa ttcttcgtgc tttatttctt ttcctttttg tttttttttg ccatttatct  6960
aatgcaagtg ggcttataaa atcagtgaat ttcttggaaa agtaacttct ttatcgtata  7020
acatattgtg aaattatcca tttcttttaa ttttttagtg ttattggata tttttgtatg  7080
attattgatt tgcataggat aatgactttt gtatcaagtt ggtgaacaag tctcgttaaa  7140
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tatttaatta tcaaactctc cactaccttt cccaccaacc gttacaatcc tgaatgttgg  7560
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aaccaaagtg aacaaatatt gatgtacaag tttgagagga taagacattg gaatcgtcta  7860
accaggaggc ggaggaattc cctagacagt taaaagtggc cggaatcccg gtaaaaaaga  7920
ttaaaatttt tttgtagagg gagtgcttga atcatgtttt ttatgatgga aatagattca  7980
gcaccatcaa aaacattcag gacacctaaa attttgaagt ttaacaaaaa taacttggat  8040
ctacaaaaat ccgtatcgga ttttctctaa atataactag aattttcata actttcaaag   8100
caactcctcc cctaaccgta aaacttttcc tacttcaccg ttaattacat tccttaagag   8160
tgataaagaa ataaagtaaa taaaagtatt cacaaaccaa caatttattt cttttattta   8220
cttaaaaaaa caaaaagttt atttatttta cttaaatggc ataatgacat atcggagatc   8280
cctcgaacga gaatctttta tctccctggt tttgtattaa aaagtaattt attgtggggt   8340
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ttctttgtaa attgttaatg gtggtttctg tgggggaaga atcttttgcc aggtcctttt   8760
gggtttcgca tgtttatttg ggttattttt ctcgactatg gctgacatta ctagggcttt   8820
cgtgctttca tctgtgtttt cttcccttaa taggtctgtc tctctggaat atttaatttt   8880
cgtatgtaag ttatgagtag tcgctgtttg taataggctc ttgtctgtaa aggtttcagc   8940
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tttcttcttt gagcattttc ttgtggcgtt ctgtagtaat attttaattt tgggcccggg   9120
ttctgagggt aggtgattat tcacagtgat gtgctttccc tataaggtcc tctatgtgta   9180
agctgttagg gtttgtgcgt tactattgac atgtcacatg tcacatattt tcttcctctt   9240
atccttcgaa ctgatggttc tttttctaat tcgtggattg ctggtgccat attttatttc   9300
tattgcaact gtattttagg gtgtctcttt ctttttgatt tcttgttaat atttgtgttc   9360
aggttgtaac tatgggttgc tagggtgtct gccctcttct tttgtgcttc tttcgcagaa   9420
tctgtccgtt ggtctgtatt tgggtgatga attatttatt ccttgaagta tctgtctaat   9480
tagcttgtga tgatgtgcag gtatattcgt tagtcatatt tcaatttcaa gcgatccccc   9540
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atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt   9780
gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg   9840
tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca   9900
cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtaagtttct gcttctacct ttgatatata   9960
tataataatt atcattaatt agtagtaata taatatttca aatatttttt tcaaaataaa  10020
agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat  10080
aacttttcta atatatgacc aaaatttgtt gatgtgcagg tatcaccgtt tgtgtgaaca  10140
acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga  10200
aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc  10260
tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag  10320
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cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgctgaag  10740
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cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg cgtaaactcg  11040
acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac accgatacca  11100
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tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg tatcaccgcg  11340
tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc gattttgcga  11400
cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg gatcttcact cgcgaccgca  11460
aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac ttcggtgaaa  11520
aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc tggcgcacca tcgtcggcta  11580
cagcctcggg aattgctacc gagggttcga aatcgatggg tgttatttgt ggataataaa  11640
ttcgggtgat gttcagtgtt tgtcgtattt ctcacgaata aattgtgttt atgtatgtgt  11700
tagtgttgtt tgtctgtttc agaccctctt atgttatatt tttcttttcg tcggtcagtt  11760
gaagccaata ctggtgtcct ggccggcact gcaataccat ttcgtttaat ataaagactc  11820
tgttatccgt gagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa  11880
gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta  11940
agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta  12000
gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg  12060
ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg cggccgcatt tgggctcctg  12120
caggtacctt aattaaaagt ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa  12180
cctaagagaa aagagcgttt attagaataa tcggatattt aaaagggcgt gaaaaggttt  12240
atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt tccccagatc             12290
<210>60
<211>4289
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成寡核苷酸构建体
<400>60
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt    60
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac   120
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg   180
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc   240
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata   300
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt   360
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag   420
gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga   480
taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctgag agacataatt   540
gtggtttgtg tttccatatt gttcatctcc cattgatcgt attaagaaag tatgatggtg   600
atgtcgcagc cttccgcttt cgcttcacgg aaaacctgaa gcacactctc ggcgccattt   660
tcagtcagct gcttgctttg ttcaaactgc ctccattcca aaacgagcgg gtactccacc   720
catccggtca gacaatccca taaagcgtcc aggttttcac cgtagtattc cggaagggca   780
agctcctttt tcaatgtctg gtggaggtcg ctgatacttc tgatttgttc cccgttaatg   840
actgcttttt tcatgtgcgg ctcctttctt atgattttat tctatcagtt taccattttt   900
ctcttcagaa atggccggat tctgccccgg tttcagctgg acgatgtcct cctgtctcgg   960
acggctgctg caaattggac cacattatgg tctctcagct tgcatgccaa acttttaatt  1020
aaggtacctg caggagcccg ggctctcgag taaaacataa ttttggcagt aaaaagtgaa  1080
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gaaggcaaac tcccgggcaa aagcggacga acatggcgtg aagcggatat taactataca  1680
tcaggcttca gaaattcaga ccggattctt tactcaagcg actggctgat ttacaaaaca  1740
acggacgagt atcagacctt tacaaaaatc agataacgaa aaaaacggct tccctgcggg  1800
aggccgtttt tttcagcttt acataaagtg tgtaataaat ttttcttcaa actctgatcg  1860
gtcaagagct cttctgagag acaatacata catgtctctg atgttgtaac tttactacca  1920
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gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact  3060
attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca  3120
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tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg  3240
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aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg  3420
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<210>61
<211>13383
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成寡核苷酸构建体
<400>61
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gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg caggtggtgg ccaatggtga  11460
tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca acaggtggtt gcaactggac aaggcactag  11520
cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg ggtgaaggtt atctctatga  11580
actgtgcgtc acagccaaaa gccagacaga gtgtgatatc tacccgcttc gcgtcggcat  11640
ccggtcagtg gcagtgaagg gcgaacagtt cctgattaac cacaaaccgt tctactttac  11700
tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt gcgtggcaaa ggattcgata acgtgctgat  11760
ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta  11820
cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga  11880
aactgctgct gtcggcttta acctctcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc  11940
gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc  12000
gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc  12060
caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat ttcgcgccac tggcggaagc  12120
aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc aatgtaatgt tctgcgacgc  12180
tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc ctgaaccgtt attacggatg  12240
gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta ctggaaaaag aacttctggc  12300
ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa tacggcgtgg atacgttagc  12360
cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag tatcagtgtg catggctgga  12420
tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc ggtgaacagg tatggaattt  12480
cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc ggtaacaaga aagggatctt  12540
cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc ttttctgctg caaaaacgct ggactggcat  12600
gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg caaacaatga atcaacaact ctcctggcgc  12660
accatcgtcg gctacagcct cgggaattgc taccggggtt cgaaatcgat gggtgttatt  12720
tgtggataat aaattcgggt gatgttcagt gtttgtcgta tttctcacga ataaattgtg  12780
tttatgtatg tgttagtgtt gtttgtctgt ttcagaccct cttatgttat atttttcttt  12840
tcgtcggtca gttgaagcca atactggtgt cctggccggc actgcaatac catttcgttt  12900
aatataaaga ctctgttatc cgtgagctcg aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa  12960
taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg  13020
ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg  13080
gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag  13140
cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcgcggccgc  13200
atttgggctc ctgcaggtac cttaattaaa agtttaaact atcagtgttt gacaggatat  13260
attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg  13320
cgtgaaaagg tttatccgtt cgtccatttg tatgtgcatg ccaaccacag ggttccccag  13380
atc                                                                13383
<210>62
<211>11300
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成寡核苷酸构建体
<400>62
cgccggcgtt gtggatacct cgcggaaaac ttggccctca ctgacagatg aggggcggac  60
gttgacactt gaggggccga ctcacccggc gcggcgttga cagatgaggg gcaggctcga 120
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gctgacagat gaggggcgca cctattgaca tttgaggggc tgtccacagg cagaaaatcc  360
agcatttgca agggtttccg cccgtttttc ggccaccgct aacctgtctt ttaacctgct  420
tttaaaccaa tatttataaa ccttgttttt aaccagggct gcgccctgtg cgcgtgaccg  480
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gctggcagtc cataattgtg ggctgagaga cataattgtg gtttgtgttt ccatattgtt  660
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attatggtct ctcccataat tgtggtttca aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg 1140
ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa 1200
ggaacagtga attggagttc gtcttgttat aattagcttc ttggggtatc tttaaatact 1260
gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa 1320
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tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg gcgaccacta cacgaaattc atatgggaga 3300
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cagttccggc tgggggttca gcagccagcg ctttactggc atttcaggaa caagcgggca 3600
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gagctgttgg ctggctggtg gcaggatata ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca  4020
acttaataac acattgcgga cgtttttaat gtactggggt ggtttttctt ttcaccagtg  4080
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aacagcaaaa gctgcaaccc cttgtgctgg ttcgttccta cagttggacg cagcccgagt  7080
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caaatattac aatcgtttgt ttctacaaac aaatcttttt cagaacggct tcaggtgggg   7200
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<210>63
<211>12509
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成寡核苷酸构建体
<400>63
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tgtcataatg aattaatttg taacctattt ataaattcaa aaatgtcatc atattactac  11280
ttttgaccat ttaatattag atttctcatt tggtcaatac ccaatgttca tattacatat  11340
atagagacaa aaattataag gatactaaat tgttcatatt tcttggaagt aaaaagatta  11400
atgatcactg aataaataga tttggcatag aagtatagca ttggaattgc ttcaacatct  11460
ttggtgtaga tagatttatg caatttctct ttctttttga agtatctttt tttttctaga  11520
gagagaataa tgttagggat ttttatcatt ttctctctca ttatgggtac tgagaggaaa  11580
gtgagatttt tagtacggat ccaatagttt aagagtttgg tctgccttct acgatccaaa  11640
aaaatctacg gtcatgatct ctccatcgag aaggttgaga gttcagacat caaagtctat  11700
aatatgtcat tgtaatacgt atttgtgcat atatatctat gtacaagtac atatacagga  11760
aactcaagaa aaaagaataa atggtaaatt taattatatt ccaaataagg aaagtatgga  11820
acgttgtgat gttactcgga caagtcattt agttacatcc atcacgttta aatttaatcc  11880
aatggttaca attttaatac tatcaaatgt ctattggatt tatacccaat gtgttaatgg  11940
gttgttgaca catgtcacat gtctgaaacc ctagacatgt tcagaccaat catgtcactc  12000
taattttgcc agcatggcag ttggcagcca atcactagct cgataaattt aaggtttcag  12060
aggaatttta atttatttag ggttcatatt gtttcataaa atgattcttt atttgttaca  12120
actttaagga aatattttat taactattta attgttccct tttcttatat tacttttgtt  12180
ttttcttcac atcatgtgtc acattaagtt gcatttcttc tgactcaaaa gaaccgatgt  12240
ttgcttttaa ggtttcgtat tagaatcact taactgtgca agtggtcgat ttgaccctat  12300
caagcttgat atcgaattgc ggccgcattt gggctcctgc aggtacctta attaaaagtt  12360
taaactatca gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta  12420
ttagaataat cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg  12480
tgcatgccaa ccacagggtt ccccagatc                                  12509
<210>64
<211>597
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>64
tgccaagaat gtaagttttt atttctttta tatgttcaaa cagttttata aagtactata   60
agcttttttt agccaaaaga aatatcttaa gttttagtaa ccaataaaga attattgcgg  120
cctccttatt taattatagt acatatgtca tagtagatgt tttttttatt attattattt  180
tttatttttt tatagttttt tacaaattcg acttggagac cttatgattt ggaagatact  240
ccatttaatt ttatgagttg tgtttgaaaa catattttaa gactaaacac gtagagaaca  300
ttcttaacaa atttgtaaat aaataaattt aactctattc tctaggattt aaatattata  360
ggtatatata taattttcta ataagtttat atcgagtcac tcatacgagt tgtgtagaaa  420
gttaatcacg ggtaccaatt ttaaattaaa aataagaata attatatgat cttaaattta  480
tacaactctg ataaaagatt gggctttgac atctttgaag aaaactagat ttagtaatat  540
tctgattaaa ttgggttcac actttgtagt gggcacactt tccgggttcg aaatcga     597
<210>65
<211>2043
<212>DNA
<213>巨桉
<400>65
gcgccaccac caaacgctca ccttctcatc atcagccctc tgtctctgtc tctgtctctc    60
gattctccgc cccgccacga caatggaggc gaagccgtcg gagcagcccc gcgagttcat   120
cttccggtcg aagctccccg acatctacat tcccgacaac ctctccctcc acgcctactg   180
cttcgagaac atctccgagt tcgccgaccg cccctgcgtc atcaacgggg ccaccggccg   240
gacctacacc tatgccgagg tcgagctgat ctcccgccgg gtctcagccg gcctcaacgg   300
gctcggcgtc ggacagggcg acgtgatcat gctgctcctc cagaactgcc ctgagttcgt   360
gttcgcgttc ctcggcgcgt cctaccgggg cgccatcagc acgaccgcga acccgttcta   420
caccccgggc gagatcgcca agcaggcctc agctgcccgg gccaagatcg tgatcacgca   480
ggccgcgttc gccgacaagg tgaggccgtt cgcggaggag aacggggtga aggtcgtgtg   540
catcgatacc gcgccggagg gctgcctgca cttctcggaa ttgatgcagg cggacgagaa   600
cgccgccccc gcggcggacg tcaagccgga cgacgtcttg gcgctcccct attcgtcggg   660
cacgacgggg cttcccaagg gagtgatgct tacgcacagg ggtcaagtga ccagcgtggc   720
gcagcaggtc gacggagaca accccaactt gtacttccac aaggaggacg tgatcctgtg   780
cacgctcccg ttgttccaca tatactccct caactcggtg atgttctgcg cgctccgtgt   840
cggcgccgcc atcctgatca tgcagaagtt cgagatcgtg gcgctgatgg agctcgtgca   900
gcggtaccgg gtgacgatcc tgcccattgt cccgccgatc gtgctggaga tcgccaagag   960
cgccgaggtg gaccggtacg acctgtcgtc gatccggacc atcatgtcgg gtgcggcccc  1020
gatggggaag gagctcgagg acaccgtgcg agccaagctg cccaatgcca agctcggaca  1080
gggctatggg atgacggagg cgggcccggt gctggcaatg tgcccggcat ttgcaaagga  1140
gccgttcgag atcaagtcag gcgcatgcgg gaccgtcgtg aggaacgcgg agatgaagat  1200
cgtcgacccg gagacagggg cctcgctccc gcggaaccag gccggcgaga tctgcatccg  1260
gggtcaccag atcatgaaag gttatctgaa cgacgccgag gcgaccgcaa ataccataga  1320
caaagaaggg tggctgcaca ccggcgacat cggctacata gacgatgacg acgagctctt  1380
cattgtcgat cggttgaagg aactcatcaa gtacaagggc ttccaggttg ctccggccga  1440
gctagaggca atgctgattg cacacccaag tatctcggat gccgctgttg tgccgatgaa  1500
ggatgaggtt gccggtgagg ttcctgttgc attcgtggtg aaatccaatg gttccgtaat  1560
caccgaggac gaaatcaagc aatacatctc gaagcaggtc gtgttttaca agaggatcaa  1620
gcgggttttc ttcacggacg caattccgaa agccccctcc ggaaaaatct tgaggaagga  1680
cctaagagca aagttggcct ctggtgttta caattaattt ctcataccct tttctttttc  1740
aaccctgccc ctgtacttgc ttaaagaccc atgtagttga aatgaatgta acctcttcgg  1800
aggggccaaa tatggaaggg ggaaagaaag acatatggcg atgatttgat ttcacatgct  1860
attgtaatgt atttattgtt tcaattccga attagacaaa gtgcttaaag ctctcttttc 1920
ggattttttt tttcattaat gtataataat tgcggacatt acaatatact gtacaacgtg 1980
atttgagctt gatgaattac aagattggaa gaacttcgaa gacaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040
aaa                                                               2043
<210>66
<211>2005
<212>DNA
<213>辐射松
<400>66
attcaattct tcccactgca ggctacattt gtcagacacg ttttccgcca tttttcgcct    60
gtttctgcgg agaatttgat caggttcgga ttgggattga atcaattgaa aggtttttat   120
tttcagtatt tcgatcgcca tggccaacgg aatcaagaag gtcgagcatc tgtacagatc   180
gaagcttccc gatatcgaga tctccgacca tctgcctctt cattcgtatt gctttgagag   240
agtagcggaa ttcgcagaca gaccctgtct gatcgatggg gcgacagaca gaacttattg   300
cttttcagag gtggaactga tttctcgcaa ggtcgctgcc ggtctggcga agctcgggtt   360
gcagcagggg caggttgtca tgcttctcct tccgaattgc atcgaatttg cgtttgtgtt   420
catgggggcc tctgtccggg gcgccattgt gaccacggcc aatcctttct acaagccggg   480
cgagatcgcc aaacaggcca aggccgcggg cgcgcgcatc atagttaccc tggcagctta   540
tgttgagaaa ctggccgatc tgcagagcca cgatgtgctc gtcatcacaa tcgatgatgc   600
tcccaaggaa ggttgccaac atatttccgt tctgaccgaa gccgacgaaa cccaatgccc   660
ggccgtgaca atccacccgg acgatgtcgt ggcgttgccc tattcttccg gaaccacggg   720
gctccccaag ggcgtgatgt taacgcacaa aggcctggtg tccagcgttg cccagcaggt   780
cgatggtgaa aatcccaatc tgtatttcca ttccgatgac gtgatactct gtgtcttgcc   840
tcttttccac atctattctc tcaattcggt tctcctctgc gcgctcagag ccggggctgc   900
gaccctgatt atgcagaaat tcaacctcac gacctgtctg gagctgattc agaaatacaa   960
ggttaccgtt gccccaattg tgcctccaat tgtcctggac atcacaaaga gccccatcgt  1020
ttcccagtac gatgtctcgt ccgtccggat aatcatgtcc ggcgctgcgc ctctcgggaa  1080
ggaactcgaa gatgccctca gagagcgttt tcccaaggcc attttcgggc agggctacgg  1140
catgacagaa gcaggcccgg tgctggcaat gaacctagcc ttcgcaaaga atcctttccc  1200
cgtcaaatct ggctcctgcg gaacagtcgt ccggaacgct caaataaaga tcctcgatac  1260
agaaactggc gagtctctcc cgcacaatca agccggcgaa atctgcatcc gcggacccga  1320
aataatgaaa ggatatatta acgacccgga atccacggcc gctacaatcg atgaagaagg  1380
ctggctccac acaggcgacg tcgggtacat tgacgatgac gaagaaatct tcatagtcga  1440
cagagtaaag gagattatca aatataaggg cttccaggtg gctcctgctg agctggaagc  1500
tttacttgtt gctcatccgt caatcgctga cgcagcagtc gttcctcaaa agcacgagga  1560
ggcgggcgag gttccggtgg cgttcgtggt gaagtcgtcg gaaatcagcg agcaggaaat  1620
caaggaattc gtggcaaagc aggtgatttt ctacaagaaa atacacagag tttactttgt  1680
ggatgcgatt cctaagtcgc cgtccggcaa gattctgaga aaggatttga gaagcagact  1740
ggcagcaaaa tgaaaatgaa tttccatatg attctaagat tcctttgccg ataattatag  1800
gattcctttc tgttcacttc tatttatata ataaagtggt gcagagtaag cgccctataa  1860
ggagagagag agcttatcaa ttgtatcata tggattgtca acgccctaca ctcttgcgat  1920
cgctttcaat atgcatatta ctataaacga tatatgtttt ttttataaat ttactgcact  1980
tctcgttcaa aaaaaaaaaa aaaaa                                        2005
<210>67
<211>372
<212>DNA
<213>辐射松
<400>67
atccttgggc agggatacgg catgacagaa gcaggcccgg tgctggcaat gaacctagcc   60
ttcgcaaaga atcctttccc cgtcaaatct ggctcctgcg gaacagtcgt ccggaacgct  120
caaataaaga tcctcgatac agaaactggc gagtctctcc cgcacaatca agccggcgaa  180
atctgcatcc gcggacccga aataatgaaa ggatatatta acgacccgga atccacggcc  240
gctacaatcg atgaagaagg ctggctccac acaggcgacg tcgggtacat tgacgatgac 300
gaagaaatct tcatagtcga cagagtaaag gagattatca atataaaggc ttccaggtgg 360
atcctgctaa tc                                                     372
<210>68
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>68
gaagaaagcc gaaataaaga gg                   22
<210>69
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>69
ttgaacgtat agtcgccgat ag                   22
<210>70
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>70
aaggagatat aacaatgatt gaacaagatg gattgc    36
<210>71
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>71
tcagaagaac tcgtcaagaa gg                   22
<210>72
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>72
cgaaaacggc aagaaaaagc ag    22
<210>73
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>73
acgaccaaag ccagtaaagt ag    22
<210>74
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>74
aatgggaagc ctgagtttac a     21
<210>75
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的名称：合成引物
<400>75
ggccagcatg ttttcctcca g     21
<210>76
<211>2064
<212>DNA
<213>辐射松
<400>76
aaaacccctc acaaatacat aaaaaaaatt ctttatttaa ttatcaaact ctccactacc    60
tttcccacca accgttacaa tcctgaatgt tggaaaaaac taactacatt gatataaaaa   120
aactacatta cttcctaaat catatcaaaa ttgtataaat atatccactc aaaggagtct   180
agaagatcca cttggacaaa ttgcccatag ttggaaagat gttcaccaag tcaacaagat   240
ttatcaatgg aaaaatccat ctaccaaact tactttcaag aaaatccaag gattatagag   300
taaaaaatct atgtattatt aagtcaaaaa gaaaaccaaa gtgaacaaat attgatgtac   360
aagtttgaga ggataagaca ttggaatcgt ctaaccagga ggcggaggaa ttccctagac   420
agttaaaagt ggccggaatc ccggtaaaaa agattaaaat ttttttgtag agggagtgct   480
tgaatcatgt tttttatgat ggaaatagat tcagcaccat caaaaacatt caggacacct   540
aaaattttga agtttaacaa aaataacttg gatctacaaa aatccgtatc ggattttctc   600
taaatataac tagaattttc ataactttca aagcaactcc tcccctaacc gtaaaacttt   660
tcctacttca ccgttaatta cattccttaa gagtagataa agaaataaag taaataaaag   720
tattcacaaa ccaacaattt atttctttta tttacttaaa aaaacaaaaa gtttatttat   780
tttacttaaa tggcataatg acatatcgga gatccctcga acgagaatct tttatctccc   840
tggttttgta ttaaaaagta atttattgtg gggtccacgc ggagttggaa tcctacagac   900
gcgctttaca tacgtctcga gaagcgtgac ggatgtgcga ccggatgacc ctgtataacc   960
caccgacaca gccagcgcac agtatacacg tgtcatttct ctattggaaa atgtcgttgt  1020
tatccccgct ggtacgcaac caccgatggt gacaggtcgt ctgttgtcgt gtcgcgtagc  1080
gggagaaggg tctcatccaa cgctattaaa tactcgcctt caccgcgtta cttctcatct  1140
tttctcttgc gttgtataat cagtgcgata ttctcagaga gcttttcatt caaaggtatg  1200
gagttttgaa gggctttact cttaacattt gtttttcttt gtaaattgtt aatggtggtt  1260
tctgtggggg aagaatcttt tgccaggtcc ttttgggttt cgcatgttta tttgggttat  1320
ttttctcgac tatggctgac attactaggg ctttcgtgct ttcatctgtg ttttcttccc  1380
ttaataggtc tgtctctctg gaatatttaa ttttcgtatg taagttatga gtagtcgctg  1440
tttgtaatag gctcttgtct gtaaaggttt cagcaggtgt ttgcgtttta ttgcgtcatg  1500
tgtttcagaa ggcctttgca gattattgcg ttgtacttta atattttgtc tccaaccttg  1560
ttatagtttc cctcctttga tctcacagga accctttctt ctttgagcat tttcttgtgg  1620
cgttctgtag taatatttta attttgggcc cgggttctga gggtaggtga ttattccagt  1680
gatgtgcttt ccctataagg tcctctatgt gtaagctgtt agggtttgtg cgttactatt  1740
gacatgtcac atgtcacata ttttcttcct cttatccttc gaactgatgg ttctttttct  1800
aattcgtgga ttgctggtgc catattttat ttctattgca actgtatttt agggtgtctc  1860
tttctttttg atttcttgtt aatatttgtg ttcaggttgt aactatgggt tgctagggtg  1920
tctgccctct tcttttgtgc ttctttcgca gaatctgtcc gttggtctgt atttgggtga  1980
tgaattattt attccttgaa gtatctgtct aattagcttg tgatgatgtg caggtatatt  2040
cgttagtcat atttcaattt caag                                         2064
<210>77
<211>2251
<212>DNA
<213>火炬松
<400>77
ggccgggtgg tgacatttat tcataaattc atctcaaaac aagaaggatt tacaaaaata   60
aaagaaaaca aaattttcat ctttaacata attataattg tgttcacaaa attcaaactt  120
aaacccttaa tataaagaat ttctttcaac aatacacttt aatcacaact tcttcaatca  180
caacctcctc caacaaaatt aaaatagatt aataaataaa taaacttaac tatttaaaaa  240
aaaatattat acaaaattta ttaaaacttc aaaataaaca aactttttat acaaaattca  300
tcaaaacttt aaaataaagc taaacactga aaatgtgagt acatttaaaa ggacgctgat  360
cacaaaaatt ttgaaaacat aaacaaactt gaaactctac cttttaagaa tgagtttgtc  420
gtctcattaa ctcattagtt ttatagttcg aatccaatta acgtatcttt tattttatgg  480
aataagggtg ttttaataag tgattttggg atttttttag taatttattt gtgatatgtt  540
atggagtttt taaaaatata tatatatata tatatttttg ggttgagttt acttaaaatt  600
tggaaaaggt tggtaagaac tataaattga gttgtgaatg agtgttttat ggatttttta  660
agatgttaaa tttatatatg taattaaaat tttattttga ataacaaaaa ttataattgg  720
ataaaaaatt gttttgttaa atttagagta aaaatttcaa aatctaaaat aattaaacac  780
tattattttt aaaaaatttg ttggtaaatt ttatcttata tttaagttaa aatttagaaa  840
aaattaattt taaattaata aacttttgaa gtcaaatatt ccaaatattt tccaaaatat   900
taaatctatt ttgcattcaa aatacaattt aaataataaa acttcatgga atagattaac   960
caatttgtat aaaaaccaaa aatctcaaat aaaatttaaa ttacaaaaca ttatcaacat  1020
tatgatttca agaaagacaa taaccagttt ccaataaaat aaaaaacctc atggcccgta  1080
attaagatct cattaattaa ttcttatttt ttaatttttt tacatagaaa atatctttat  1140
attgtatcca agaaatatag aatgttctcg tccagggact attaatctcc aaacaagttt  1200
caaaatcatt acattaaagc tcatcatgtc atttgtggat tggaaattat attgtataag  1260
agaaatatag aatgttctcg tctagggact attaatttcc aaacaaattt caaaatcatt  1320
acattaaagc tcatcatgtc atttgtggat tggaaattag acaaaaaaaa tcccaaatat  1380
ttctctcaat ctcccaaaat atagttcgaa ctccatattt ttggaaattg agaatttttt  1440
tacccaataa tatatttttt tatacatttt agagattttc cagacatatt tgctctggga  1500
tttattggaa tgaaggttga gttataaact ttcagtaatc caagtatctt cggtttttga  1560
agatactaaa tccattatat aataaaaaca cattttaaac accaatttaa tgggatttca  1620
gatttgtatc ccatgctatt ggctaaggca tttttcttat tgtaatctaa ccaattctaa  1680
tttccaccct ggtgtgaact gactgacaaa tgcggtccga aaacagcgaa tgaaatgtct  1740
gggtgatcgg tcaaacaagc ggtgggcgag agagcgcggg tgttggccta gccgggatgg  1800
gggtaggtag acggcgtatt accggcgagt tgtccgaatg gagttttcgg ggtaggtagt  1860
aacgtagacg tcaatggaaa aagtcataat ctccgtcaaa aatccaaccg ctccttcaca  1920
tcgcagagtt ggtggccacg ggaccctcca cccactcact cgatcgcctg ccgtggttgc  1980
ccattattca accatacgcc acttgactct tcaccaacaa ttccaggccg gctttctata  2040
caatgtactg cacaggaaaa tccaatataa aaagccggcc tctgcttcct tctcagtagc  2100
ccccagctca ttcaattctt cccactgcag gctacatttg tcagacacgt tttccgccat  2160
ttttcgcctg tttctgcgga gaatttgatc aggttcggat tgggattgaa tcaattgaaa  2220
ggtttttatt ttcagtattt cgatcgccat g                                 2251

Claims (94)

1、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分，
间隔区DNA片段，和
与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，
其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列。
2、如权利要求1所述的DNA构建体，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。
3、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述启动子是组成型启动子。
4、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述启动子是组织特异性启动子。
5、如权利要求4所述的DNA构建体，其中所述启动子以维管优选方式引导表达以便在植物木质部中发生表达。
6、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述启动子来自火炬松(P.taeda)的4CL启动子。
7、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分具有选自由约50bp、100bp、200bp、400bp、600bp和1000bp组成群组的片段长度。
8、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分具有约200bp的片段长度。
9、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分具有约334bp的片段长度。
10、如权利要求1所述的DNA构建体，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因是4CL基因。
11、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分选自由SEQ IDNO 18、19、20、21、22、23、24和178组成的群组。
12、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分包括SEQ IDNO：18的核苷酸序列。
13、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分包括SEQ IDNO：23的核苷酸序列。
14、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分包括SEQ IDNO：163的核苷酸序列。
15、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述间隔区DNA片段为内含子的至少一部分。
16、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述间隔区DNA片段包含选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：194组成的群组的核苷酸序列。
17、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述启动子为维管优选型启动子且所述第一段DNA片段包括SEQ ID NO：163的核苷酸序列。
18、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述启动子为维管优选型启动子且所述第一段DNA片段包括SEQ ID NO：18的核苷酸序列。
19、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述启动子为维管优选型启动子且所述第一段DNA片段包括SEQ ID NO：23的核苷酸序列。
20、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体选自由pARB345、pWVK158、pWVK154、pWVK143、pWVC46、pWVC40和pWVC44组成的群组。
21、如权利要求1所述的DNA构建体，其进一步包括至少一个T-DNA边界。
22、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于LIM基因的至少一部分，
间隔区DNA片段，和
与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，
其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列。
23、一种调节植物中木质素表达的方法，其包括将如权利要求1所述的DNA构建体导入所述植物中并使所述植物生长。
24、一种抑制植物中木质素表达的方法，其包括将如权利要求1所述的DNA构建体导入所述植物中并使所述植物生长。
25、一种减少植物中木质素表达的方法，其包括将如权利要求1所述的DNA构建体导入所述植物中并使所述植物生长。
26、一种抑制植物细胞中木质素表达的方法，所述方法包括将沿5′至3′方向包含下列各部分的DNA构建体整合于所述植物细胞的基因组中：启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；及使所述植物细胞生长。
27、如权利要求26所述的方法，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。
28、如权利要求26所述的方法，其中所述基因的所述部分具有约50bp、100bp、200bp、400bp、600bp和1000bp的片段长度。
29、如权利要求26所述的方法，其中所述基因的所述部分具有约200bp的片段长度。
30、如权利要求26所述的方法，其中所述基因的所述部分具有约334bp的片段长度。
31、如权利要求26所述的方法，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因是4CL。
32、如权利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分选自由SEQ ED NO 18、19、20、21、22、23、24和178组成的群组。
33、如权利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分包括SEQ ID NO：18的核苷酸序列。
34、如权利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分包括SEQ ID NO：23的核苷酸序列。
35、如权利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分包括SEQ ID NO：163的核苷酸序列。
36、如权利要求31所述的方法，其中所述DNA构建体选自由pARB345、pWVK158、pWVK154、pWVK143、pWVC46、pWVC40和pWVC44组成的群组。
37、如权利要求26所述的方法，其中所述整合是使用一个以上的DNA构建体实现。
38、如权利要求26所述的方法，其中所述植物是裸子植物。
39、一种包含如权利要求1所述的DNA构建体的植物。
40、一种包含如权利要求1所述的DNA构建体的植物细胞。
41、一种植物细胞，其沿5’至3’方向包含启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段。
42、如权利要求41所述的植物细胞，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。
43、如权利要求41所述的植物细胞，其中所述启动子对于所述植物细胞而言是内源性的。
44、一种包含如权利要求41所述的植物细胞的植物。
45、一种源自如权利要求44所述的转基因植物的纸浆和纸浆制品。
46、一种源自如权利要求44所述的转基因植物的实木制品。
47、如权利要求46所述的木制品，其中所述制品选自由木料(timber)、木材(lumber)和复合材料组成的群组。
48、一种具有减少的木质素含量的植物，其通过如权利要求26所述的方法产生。
49、一种源自如权利要求48所述的转基因植物的纸浆和纸浆制品。
50、一种源自如权利要求44所述的转基因植物的实木制品。
51、如权利要求50所述的木制品，其中所述制品选自由木料、木材和复合材料组成的群组。
52、一种制造木头(wood)的方法，其包括将沿5′至3′方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中：启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述木头。
53、如权利要求52所述的方法，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。
54、一种通过如权利要求52所述的方法获得的木头。
55、一种制造木浆的方法，其包括将沿5′至3′方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中：启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述木浆。
56、如权利要求55所述的方法，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。
57、一种通过如权利要求55所述的方法获得的木浆。
58、一种造纸方法，其包括将沿5′至3′方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中：启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述纸。
59、如权利要求58所述的方法，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。
60、一种通过如权利要求58所述的方法获得的纸。
61、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分，
间隔区DNA片段，和
与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，
其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列且木质素单体生物合成途径中的所述基因是4CL基因且其中所述DNA构建体选自由pARB1202、pARB675和pARB599组成的群组。
62、如权利要求61所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB 1202。
63、如权利要求61所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB675。
64、如权利要求61所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB599。
65、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿反义方向生成所述DNA片段的转录本，其中所述DNA构建体为pARB1201、pARB598、pARB411和pARB412。
66、如权利要求65所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB1201。
67、如权利要求65所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB598。
68、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿正义方向生成所述DNA片段的转录本，其中所述DNA构建体为pARB368。
69、如权利要求68所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB1203。
70、如权利要求68所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB 1205。
71、如权利要求68所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB675。
72、如权利要求68所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB661。
73、如权利要求68所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB662。
74、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到对应于CAld5H基因的至少一部分的DNA片段上的启动子，其中所述DNA构建体选自由pARB1203、pARB1205、pARB675、pARB661、pARB662和pARB374组成的群组。
75、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到对应于SAD基因的至少一部分的DNA片段上的启动子，其中所述DNA构建体选自由pARB486、pARB487和pARB488组成的群组。
76、一种包含如权利要求61所述的DNA构建体的植物细胞。
77、一种包含如权利要求65所述的DNA构建体的植物细胞。
78、一种包含如权利要求68所述的DNA构建体的植物细胞。
79、一种包含如权利要求74至78中任一项所述的植物细胞的植物。
80、一种源自如权利要求79所述的植物的纸浆和纸浆制品。
81、一种源自如权利要求79所述的植物的实木制品。
82、如权利要求81所述的木制品，其中所述制品选自由木料、木材和复合材料组成的群组。
83、一种抑制植物中木质素表达的方法，其包括将如权利要求61至67中任一项所述的DNA构建体整合于所述植物的基因组中。
84、一种改变植物中木质素组成的方法，其包括将如权利要求68至73中任一项所述的DNA构建体整合于所述植物的基因组中。
85、如权利要求84所述的方法，其中所述木质素组成的改变包括调控转化植物中的愈创木基木质素单体∶紫丁香基木质素单体比率。
86、一种制造木头的方法，其包括将如权利要求61至68中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述木头。
87、一种制造木头的方法，其包括将如权利要求68至73中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述木头。
88、一种通过如权利要求86或87所述的方法获得的木头。
89、一种制造木浆的方法，其包括将如权利要求61至68中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述木头。
90、一种制造木浆的方法，其包括将如权利要求68至73中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述木头。
91、一种通过如权利要求89或90所述的方法获得的木浆。
92、一种造纸方法，其包括将如权利要求61至68中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述纸。
93、一种造纸方法，其包括将如权利要求68至73中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述纸。
94、一种通过如权利要求92或93所述的方法获得的纸。
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