CN111118059B - 一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因nptⅱ的重组质粒、重组菌及应用 - Google Patents

一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因nptⅱ的重组质粒、重组菌及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111118059B
CN111118059B CN202010031979.4A CN202010031979A CN111118059B CN 111118059 B CN111118059 B CN 111118059B CN 202010031979 A CN202010031979 A CN 202010031979A CN 111118059 B CN111118059 B CN 111118059B
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant plasmid
gene
recombinant
seeds
astaxanthin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010031979.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111118059A (zh
Inventor
何明霞
黄俊潮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kunming Institute of Botany of CAS
Original Assignee
Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kunming Institute of Botany of CAS filed Critical Kunming Institute of Botany of CAS
Priority to CN202010031979.4A priority Critical patent/CN111118059B/zh
Publication of CN111118059A publication Critical patent/CN111118059A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111118059B publication Critical patent/CN111118059B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13129—Beta-carotene 3-hydroxylase (1.14.13.129)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01032—15-Cis-phytoene synthase (2.5.1.32)

Abstract

本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒、重组菌及应用，属于基因工程育种技术领域；所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ。本发明将四个虾青素合成关键酶基因用2A短肽序列连接，能够简化重组质粒(表达载体)的构建，并实现各基因的协同表达。另外，本发明的重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ，增加了重组质粒用于转基因的安全性。

Description

一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重 组质粒、重组菌及应用
技术领域
本发明涉及基因工程育种技术领域，尤其涉及一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒、重组菌及应用。
背景技术
虾青素是一种分子结构独特的红色酯溶性酮式类胡萝卜素，具有极强的抗氧化活性以及抗辐射，抗衰老、抗肿瘤和预防心血管等疾病的功能。虾青素的生物合成只发生于少量细菌和绿藻中，且产量很低；植物中也只有夏侧金盏花(Adonis aestivalis)可以在其花瓣中合成微量的虾青素。由于虾青素的自然资源有限，科学家们都在通过基因工程方法寻求不同的植物来生产更高产量的天然虾青素，并在莴苣、马铃薯、小麦、油菜、烟草、番茄和水稻等植物中获得成功。但在这些转基因植物中经常使用潮霉素抗性基因(HPT)、卡那霉素抗性基因(NPTⅡ)和草丁膦抗性基因(BAR)等抗性标记基因筛选以获得成功转化的细胞。由于这些抗性基因存在对食品和生态环境的潜在危害，已经成为影响转基因植物商品化应用的主要障碍，当务之急是培育出不含抗性标记基因、安全的能生产虾青素的转基因植物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒、重组菌及应用，该重组质粒、重组菌能够用于培育不含抗性标记基因NPTⅡ的转基因植物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ。
优选的，所述重组质粒以Napin启动子作为启动子。
本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在亚麻荠育种中的应用。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子中类胡萝卜素的含量中的应用。
优选的，所述类胡萝卜素包括虾青素。
优选的，所述类胡萝卜素还包括新黄质、酮式叶黄素、虾青素、叶黄素、酯化叶黄素、叶绿素、隐黄质、海胆酮、番茄红素、α-胡萝卜素和/或β胡萝卜素。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子总抗氧化能力中的应用。
优选的，所述应用包括以下步骤：
将所述重组质粒或者重组菌导入亚麻荠植株，培育，得到亚麻荠种子，从亚麻荠种子中选择颜色为红色的种子，得到目标亚麻荠种子。
优选的，所述导入的方法包括农杆菌花序浸染法。
本发明的有益效果：本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ。本发明的虾青素合成酶融合基因包括将虾青素合成途径中的三个关键酶基因以及促进有色体分化与类胡萝卜素储藏的Orange(来自花椰菜)基因，其中三个关键酶基因分别是来自莱茵衣藻的β-胡萝卜素酮化酶(CrBKT)和来自雨生红球藻的羟化酶(HpBHY)基因、八氢番茄红素合成酶(CrtB)基因。本发明将四个关键酶基因用2A短肽序列连接，能够简化重组质粒(表达载体)的构建，并实现各基因的协同表达。另外，本发明的重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ，增加了重组质粒用于转基因的安全性。通过农杆菌花序浸染法将本发明的重组质粒导入亚麻荠植株，得到的亚麻荠转化植株，经检测，亚麻荠转化植株的种子中总类胡萝卜素含量为913.54μg/gDW，是野生型(16.08μg/gDW)的56倍，更为重要的是虾青素含量由0增加至42.72μg/gDW。亚麻荠转化植株种子总抗氧化能力转化株系显著高于野生型。亚麻荠转化植株种子可以直接通过常规物理榨油方式获得亚麻荠籽油，比传统的通过超临界CO2临界萃取的方法简单快捷，且低成本高效率；同时利用本发明的重组质粒用于亚麻荠育种，能够获得安全性更高、品质更好的亚麻荠株系，使得转基因亚麻荠产品商品化成为可能。因此，将本发明的重组质粒用于亚麻荠育种，并利用亚麻荠生产高品质的、兼具不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的食用油具有极大的商业前景。
附图说明
图1为本发明重组质粒图谱；
图2为T0转化成功幼苗和野生型幼苗实物图，其中A为T0转化成功幼苗，B为野生型幼苗；
图3为T1代种子和野生型种子实物图，其中A为T1代种子，B为野生型种子；
图4为T1代种子色素提取液和野生型种子色素提取液实物图，其中A为T1代种子色素提取液；B为野生型种子色素提取液；
图5为T1代株系种子的PCR扩增结果；
图6为转化子种子UHPLC色谱图；
图7为野生型种子UHPLC色谱图；
图8为转化子种子和野生型种子总抗氧化能力分析结果。
具体实施方式
本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：cccgggacaaagagtaaagaagaacaatggcatcttctatgctgtcttctgcgactatggttgcgtctccggctcaggctactatggtggcaccgttcaacggtctgaagtcctccgcggctttcccggctactcgtaaagcgaacaacgacattaccagcattacctctaacggtggtcgtgtgaactgcatgaacaacccgtctctgctgaaccatgcggtggaaaccatggcggtgggttccaaatccttcgcgaccgcgtctaagctgttcgatgcaaagacccgtcgttctgtgctgatgctgtatgcatggtgccgccattgtgacgacgttatcgacgaccagactctgggcttccaggcacgtcagccggcgctgcagactccggaacagcgtctgatgcagctggagatgaagactcgccaggcttatgcaggctctcagatgcacgaaccggcgttcgctgctttccaggaagttgcgatggcgcatgatatcgctccggcatacgcgtttgatcatctggaaggcttcgctatggacgtgcgcgaggcgcagtactcccagctggacgataccctgcgctactgctaccacgttgctggtgttgtgggcctgatgatggcacagatcatgggtgttcgtgataacgcgaccctggatcgcgcatgtgacctgggtctggcattccagctgactaacattgcgcgtgacattgttgacgatgcgcacgcaggccgttgttatctgccggcgtcttggctggaacacgaaggcctgaacaaagaaaactacgctgcaccggaaaaccgtcaggcactgtctcgcatcgctcgccgcctggtgcaggaagcagagccgtactatctgagcgcgactgcgggcctggctggcctgccgctgcgtagcgcttgggcgattgctaccgctaagcaggtgtaccgcaaaatcggtgtgaaggttgagcaggcaggtcagcaggcgtgggatcagcgtcagtccaccactaccccggaaaaactgaccctgctgctggcagctagcggccaggcgctgacttctcgtatgcgtgcacatccgccgcgtccggcacacctgtggcagcgtccgctgtctagacagctgctgaactttgatctgctgaaactggctggtgacgtggagtctaaccctggtccgatggcgtcctctatgctgtcttctgctactatggtggcatctccggctcaggcaactatggtggcaccgtttaacggtctgaagtcttccgcagctttcccggcaactcgcaaggcaaacaacgatattactagcattacttccaacggtggccgtgttaactgcatgctgagcaagctgcagtctattagcgttaaggctcgccgtgtggagctggctcgtgacattacccgtccgaaagtttgtctgcacgcgcagcgttgtagcctggtgcgtctgcgtgtggcggctccgcagactgaagaggcactgggtaccgttcaggctgcaggtgcgggcgacgaacactccgctgatgtggctctgcagcagctggatcgtgcgattgcagaacgtcgtgcgcgtcgcaaacgcgaacagctgagctatcaggcagcggctatcgctgcttctattggtgtgtccggtattgcgatcttcgcgacctatctgcgtttcgctatgcacatgactgtgggtggtgcggttccgtggggcgaagttgcgggtactctgctgctggttgttggtggcgctctgggcatggagatgtatgcgcgttatgcgcacaaagcgatctggcacgagtccccgctgggttggctgctgcacaaaagccatcacaccccgcgtaccggtccgttcgaggctaacgatctgtttgcaatcatcaacggcctgccggcgatgctgctgtgcaccttcggcttctggctgccgaacgtgctgggcgcggcttgtttcggcgcaggtctgggtatcactctgtacggcatggcgtacatgttcgtgcatgatggtctggttcatcgtcgtttcccgactggcccgatcgcgggtctgccgtatatgaaacgcctgactgttgctcatcagctgcatcattctggcaaatatggcggtgcgccgtggggtatgttcctgggtccgcaggaactgcagcatattccgggtgcggctgaggaagtggaacgtctggtgctggaactggactggtccaaacgtcagctgctgaacttcgatctgctgaaactggcgggtgacgtggaatctaaccctggtccgatggctagctctatgctgtcctccgctaccatggttgcgtccccggcacaggcgactatggtggctccgttcaacggcctgaaatctagcgctgcatttccggcgactcgtaaggcgaacaacgacatcacttctatcaccagcaacggcggtcgcgttaactgtatgggtccgggtatccagccgaccagcgcgcgtccgtgttctcgtactaaacactctcgttttgcactgctggcggcagcactgaccgctcgtcgtgtgaaacagttcaccaagcagtttcgttctcgccgcatggcagaggacattctgaagctgtggcagcgtcagtatcatctgccgcgtgaagattctgacaagcgtaccctgcgtgagcgcgttcatctgtatcgtccgccgcgtagcgacctgggcggcatcgcggttgcggttaccgttattgctctgtgggcaaccctgtttgtttatggcctgtggttcgttaagctgccgtgggcgctgaaagttggtgagaccgctacttcttgggcgaccatcgcagcggttttcttctctctggaattcctgtacactggtctgttcatcaccactcacgatgcgatgcacggtactatcgcactgcgtaaccgtcgtctgaacgattttctgggtcagctggcaatttccctgtacgcgtggtttgactattctgtgctgcaccgtaaacattgggaacatcataaccataccggcgaaccgcgtgttgacccggacttccatcgtggcaacccgaacctggcagtgtggttcgcgcagtttatggtgagctacatgactctgtcccagtttctgaagatcgcggtttggtccaacctgctgctgctggcgggtgcgccgctggcaaaccagctgctgtttatgaccgcagcaccgatcctgtctgcgttccgcctgttctattacggcacttatgttccgcaccatccggagaagggccatactggcgcgatgccgtggcaggtttcccgcacttcttccgcatcccgcctgcagtcctttctgacttgctatcatttcgacctgcactgggagcatcatcgttggccgtatgctccgtggtgggagctgccgaaatgccgtcagatcgcacgtggcgcagctctggctcagctgctgaacttcgatctgctgaagctggcaggcgacgttgaatccaaccctgggcccatggcttcttctgcatttgcttttccttcttacataataaccaaaggaggactttcaactgattcttgtaaatcaacttctttgtcttcttctagatctttggttacagatcttccatcaccatgtctgaaacccaacaacaattcccattcaaacagaagagcaaaagtgtgtgcttcacttgcagagaagggtgaatattattcaaacagaccaccaactccattacttgacactattaactacccaatccacatgaaaaatctttctgtcaaggaactgaaacaactttctgatgagctgagatcagacgtgatctttaatgtgtcgaaaaccggtggacatttggggtcaagtcttggtgttgtggagcttactgtggctcttcattacattttcaatactccacaagacaagattctttgggatgttggtcatcagtcttatcctcataagattcttactgggagaagaggaaagatgcctacaatgaggcaaaccaatggtctctctggtttcaccaaacgaggagagagtgaacatgattgctttggtactggacacagctcaaccacaatatctgctggtttaggaatggcggtaggaagggatttgaaggggaagaacaacaatgtggttgctgtgattggtgatggtgcgatgacggcaggacaggcttatgaagccatgaacaacgccggatatctagactctgatatgattgtgattcttaatgacaacaagcaagtctcattacctacagctactttggatggaccaagtccacctgttggtgcattgagcagtgctcttagtcggttacagtctaacccggctctcagagagttgagagaagtcgcaaagggtatgacaaagcaaataggcggaccaatgcatcagttggcggctaaggtagatgtgtatgctcgaggaatgataagcggtactggatcgtcactgtttgaagaactcggtctttactatattggtccagttgatgggcacaacatagatgatttggtagccattcttaaagaagttaagagtaccagaaccacaggacctgtacttattcatgtggtgacggagaaaggtcgtggttatccttacgcggagagagctgatgacaaataccatggtgttgtgaaatttgatccagcaacgggtagacagttcaaaactactaatgagactcaatcttacacaacttactttgcggaggcattagtcgcagaagcagaggtagacaaagatgtggttgcgattcatgcagccatgggaggtggaaccgggttaaatctctttcaacgtcgcttcccaacaagatgtttcgatgtaggaatagcggaacaacacgcagttacttttgctgcgggtttagcctgtgaaggccttaaacccttctgtgcaatctattcgtctttcatgcagcgtgcttatgaccaggttgtccatgatgttgatttgcaaaaattaccggtgagatttgcaatggatagagctggactcgttggagctgatggtccgacacattgtggagctttcgatgtgacatttatggcttgtcttcctaacatgatagtgatggctccatcagatgaagcagatctctttaacatggttgcaactgctgttgcgattgatgatcgtccttcttgtttccgttaccctagaggtaacggtattggagttgcattacctcccggaaacaaaggtgttccaattgagattgggaaaggtagaattttaaaggaaggagagagagttgcgttgttgggttatggctcagcagttcagagctgtttaggagcggctgtaatgctcgaagaacgcggattaaacgtaactgtagcggatgcacggttttgcaagccattggaccgtgctctcattcgcagcttagctaagtcgcacgaggttctgatcacggttgaagaaggttccattggaggttttggctcgcacgttgttcagtttcttgctctcgatggtcttcttgatggcaaactcaagtggagaccaatggtactgcctgatcgatacattgatcacggtgcaccagctgatcaactagctgaagctggactcatgccatctcacatcgcagcaaccgcacttaacttaatcggtgcaccaagggaagctctgttttgagagctc；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ；所述重组质粒优选的以Napin启动子作为启动子。
筛选标记基因NPTⅡ是一种抗性标记基因，用于作为筛选标记，获得获得成功转化的细胞。pBI121上含有筛选标记基因NPTⅡ。本发明通过删除pBI121上的筛选标记基因NPTⅡ，能够消除重组质粒在用于植物育种过程中存在的对食品和生态环境的潜在危害。
本发明所述虾青素合成酶融合基因包括将虾青素合成途径中的三个关键酶基因以及促进有色体分化与类胡萝卜素储藏的Orange(来自花椰菜)基因，其中三个关键酶基因分别是来自莱茵衣藻的β-胡萝卜素酮化酶(CrBKT)和来自雨生红球藻的羟化酶(HpBHY)基因、八氢番茄红素合成酶(CrtB)基因。本发明将四个关键酶基因用2A短肽序列连接，能够简化重组质粒(表达载体)的构建，并实现各基因的协同表达。
本发明中，所述虾青素合成酶融合基因包括用于启动三个与虾青素等类胡萝卜素合成相关(CrtB，CrBKT，HpBHY，简称BBB)和一个促进类胡萝卜素合成(Orange)的基因。BBB的三个基因的5’端ATG前均融合有拟南芥RBCS2的叶绿体导肽序列(TP)，各基因间通过2A序列链接使四个基因的表达在同一阅读框但翻译时形成各自编码的肽。本发明对所述重组质粒的构建方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明具体实施过程中，虾青素合成酶融合基因通过全合成后克隆于pBI121，优选的利用Napin启动子控制表达形成重组质粒。
本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌；所述重组菌的原始菌优选的包括农杆菌。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在亚麻荠育种中的应用。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子中类胡萝卜素的含量中的应用；所述类胡萝卜素包括虾青素；优选的，所述类胡萝卜素还包括新黄质、酮式叶黄素、虾青素、叶黄素、酯化叶黄素、叶绿素、隐黄质、海胆酮、番茄红素、α-胡萝卜素和/或β-胡萝卜素。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子总抗氧化能力中的应用。
优选的，所述应用包括以下步骤：将所述重组质粒或者重组菌导入亚麻荠植株，培育，得到亚麻荠种子，从亚麻荠种子中选择颜色为红色的种子，得到目标亚麻荠种子；所述导入的方法包括农杆菌花序浸染法。所述红色优选为暗红色；由于类胡萝卜素为红色、黄色、橘红色色素，它在植物器官中合成后会改变植物器官的颜色，收获的T0代种子能够通过肉眼观察颜色鉴别转化成功种子。转化成功的种子由于类胡萝卜素的积累而呈现暗红色，未转化成功的种子为淡黄色，两者颜色相差较大，可以通过肉眼直接鉴定转化是否成功，简单快捷。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、材料和方法
1、材料
亚麻荠(Camelina sativa(L.))种质材料SC-N16，(参见【苑丽霞，郝敬云，赵奎，等.2EMS诱变亚麻荠获得2S贮藏蛋白缺失突变体.华北农学报，2016，31(3):11-17】)，由山西农业大学作物遗传育种重点实验室提供。将亚麻荠种子播种于直径9cm的育苗盆中，1粒/盆；盆中基质为腐殖质：泥炭土：珍珠岩＝5：4：1(体积比)；温室温度为16～22℃，光源为自然光，相对湿度为60％。待植株生长至10cm时进行摘心处理，以促进侧枝的生长和发育。植株生长约70d时进入花期准备转化，转化前一天将植株浇透水。共对20株(盆)植株进行处理，5株(盆)不处理作为对照。
2、方法
2.1植物表达载体的构建
植物表达载体pBI121-Napin-BBBO由昆明擎科生物科技有限公司合成。将pBI121用NheⅠ和ClaⅠ双酶切后回收，用T4 Ploymerase酶补平，再用T4 DNA ligase连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取菌落37℃，220rmp摇菌，菌液提取即为pBI121(-NPTⅡ)质粒。将pBI121-Napin-BBBO和pBI121(-NPTⅡ)质粒分别用HindШ和SacⅠ双酶切后回收，T4 DNA ligase酶连接后转化大肠杆菌DH5α，菌液提取质粒后双酶切进行鉴定，鉴定正确后将pBI121(-NPTⅡ)-Napin-BBBO图谱参见图1(简写为：N-BBBO(-NPTⅡ))通过电转法转化农杆菌菌株LBA4404，获得的菌株保存于-80℃冰箱用于转化亚麻荠。电转法仪采用仪器Bio-Rad GenePμlserX cellTM，电转条件为：2.5KV，电容25μF，电阻400Ω。
2.2农杆菌Floral Dip转化亚麻荠
取-80℃保存的含有重组质粒的农杆菌N-BBBO(-NPTⅡ)，在含有50mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的LB固体培养上划线，28℃下培养约36h。从平板上挑取单菌落接种于3ml含有上述抗生素的LB液体培养基中，28℃条件下，220rpm/min振荡培养过夜。吸取2ml农杆菌菌液加入250ml含有上述相应抗生素的LB液体培养基中，28℃条件下，220rpm/min振荡培养至OD600为0.8～1.0，5000rpm/min离心10min收集菌体，用等体积渗透培养基(1/2MS，5％蔗糖，0.05％Silwet L-77，PH＝5.7)悬浮菌体。转化时将种植亚麻荠植株的盆用保鲜膜包裹，植株倒立于真空桶中，花序部分浸入渗透培养基中。盖上真空桶盖，抽真空于80Kpa时开始计时，5min后将植株取出平放于铺了保鲜膜的地面并盖上黑色塑料袋。24h后将植株放置于温室培养，一星期后按照以上方法重复浸染一次后将植株置于温室常规培养直至果荚成熟，收取成熟种子标记为T0代，用于后续实验。
3、转基因植株的鉴定
3.1 T0代种子颜色鉴定
由于类胡萝卜素为红色、黄色、橘红色色素，它在植物器官中合成后会改变植物器官的颜色。收获的T0代种子通过肉眼观察种子颜色鉴别转化成功种子，并计算转化率。
3.2转化子分子鉴定
为了进一步验证，将初期筛选到的红色T0代种子进行萌发，种植于温室并收获T1代种子，对收获的红色T1代种子进行萌发即为T2植株，提取T2代植株DNA，用CRBKT引物扩增进行鉴定。
3.3类胡萝卜素测定方法
3.3.1提取方法：准确称量亚麻荠种子(0.2～0.3g)于2.0mg EP管中，每个样品设置3个重复，加入2mm钢珠2颗，200μl丙酮溶液，置于快速研磨仪中(频率65Hz，99s)研磨5次，再加500μl丙酮溶液，放置于超声波清洗器超声洗脱30min。高速离心(14800rmp/min，10min)取上清，用0.22μm滤器过滤后上样测定。
3.2.2 UHPLC方法：仪器：AgilentTechnologies 1290Infinity；色谱柱：ZORBAXEclipse(3.0×50mm 1.8-Micron，Agilent，USA)；流速：1ml/min；进样量：5μl；流动相程序：0～1.0min：水：20％，乙腈：60％，异丙醇：5％，甲醇：15％；1.0-2.0min：水：0％，乙腈：80％，异丙醇：5％，甲醇：15％；2.0-8.0min：水：0％，乙腈：80％，异丙醇：5％，甲醇：15％；
3.3.3类胡萝卜素定量：采用外标法对样品中的类胡萝卜素含量进行定量。
3.4种子总抗氧化能力测定
用苏州格锐思生物科技有限公司总抗氧化能力试剂盒进行种子总抗氧化能力的测定。
二、结果与分析
1、转基因植株的鉴定
1)植株、种子和种子色素提取液鉴定
T0转化成功幼苗和野生型幼苗实物图参见图2，其中A为T0转化成功幼苗，B为野生型幼苗；
T1代种子和野生型种子实物图参见图3，其中A为T1代种子，B为野生型种子；
T1代种子色素提取液和野生型种子色素提取液实物图参见图4，其中A为T1代种子色素提取液；B为野生型种子色素提取液。
类胡萝卜素在亚麻荠种子中积累，T0代转化成功种子与未转化种子在颜色上有明显差异，转化成功的种子呈现明显的暗红色，而未转化成功的种子呈现淡黄色。10株(盆)共收获种子1125粒，其中红色种子(转化成功)1粒，转化率为1/1125。
2)转化子N-BBBO(-NPTII)分子鉴定
为了进一步验证，将初期筛选到的红色T0代种子进行萌发并种植于温室，提取T2代植株叶片DNA，用CRBKT引物进行扩增。
正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：5'-GAACCTGGCAGTGTGGTTC-3'；
反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：5'-AAAGGACTGCAGGCGGGATG-3'。PCR扩增结果见图5，由图5可以看出，CRBKT基因在转化子中表达。
3)种子类胡萝卜素含量分析
转化子种子UHPLC色谱图参见图6，其中1.新黄质，2.酮式叶黄素，3.虾青素，4.酮式叶黄素，5.叶黄素，6.酯化叶黄素，7.叶绿素，8.隐黄质，9.海胆酮，10.番茄红素，11.α-胡萝卜素，12.β-胡萝卜素；野生型种子UHPLC色谱图参见图7，其中5.叶黄素；总类胡萝卜素含量表参见表1。由图6、图7和表1可以看出，野生型种子中仅含有叶黄素，含量为16.08μg/gDW，而转化子N-BBBO(-NPTII)种子中含有12种已确定类胡萝卜素，包含新黄质(Neoxanthin)、酮式叶黄素(ketolutein)、虾青素(Astaxanthin)、叶黄素(lutein)、酯化叶黄素(Ester-ketolutein)、叶绿素(ChlorophyII)、隐黄质(β-Cryptoxanthin)、海胆酮(Echinenone)、番茄红素(lycopene)、α-胡萝卜素(α-carotene)、β-胡萝卜素(β-carotene)，总类胡萝卜素含量为913.54μg/gDW，是野生型的56倍，虾青素含量也由0增加至42.72μg/gDW。
表1:转化子N-BBBO(-NPTⅡ)与野生型类胡萝卜素含量比较
Figure BDA0002364637920000111
**表示在p<0.05水平上的显著性差异，数据表示为平均值±标准误，n＝3。
4)种子总抗氧化能力分析
转化子种子和野生型种子总抗氧化能力分析结果参见图8(**表示在p<0.05水平上的显著性差异，数据表示为平均值±标准误，n＝3)，由图8可以看出，N-BBBO-(NPTⅡ)转化子种子总抗氧化能力为8.22μmol/g，野生型为3.02μmol/g，转化子种子总抗氧化能力明显高于野生型。高含量的总类胡萝卜素，尤其是虾青素的积累明显提高了种子总抗氧化能力。
由上述内容可以看出，本发明将虾青素合成途径中的三个关键酶基因，来自莱茵衣藻的β-胡萝卜素酮化酶(CrBKT)、来自雨生红球藻的羟化酶(HpBHY)基因、来自菠萝泛菌的八氢番茄红素合成酶(CrtB)基因，以及促进有色体分化与类胡萝卜素储藏的Orange(来自花椰菜)基因在油料作物亚麻荠中表达。同时为了简化表达载体的构建和实现各基因在亚麻荠种子中的协同表达将四个关键酶基因用手足口病2A自切割肽段连接，在种子特异性启动子NAPIN控制下通过农杆菌花序浸染法导入油料作物亚麻荠。在前期实验中我们发现转化成功的种子由于类胡萝卜素的积累而呈现暗红色，未转化成功的种子为淡黄色，两者颜色相差较大，用肉眼就可以分辨，因此在构建载体时删除了筛选标记基因(-NPTⅡ)。该方法简单快捷且安全。10株(盆)共收获种子1125粒，其中红色种子(转化成功)1粒，转化率为1/1125。用促进合成、降低产物降解等策略获得了能在种子中合成并高含量积累虾青素，同时又无选择标记基因的安全的、高品质亚麻荠株系。其总类胡萝卜素含量为913.54μg/gDW，是野生型(16.08μg/gDW)的56倍，虾青素含量由0增加至42.72μg/gDW。该转化株系种子种子总抗氧化能力转化株系显著高于野生型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院昆明植物研究所
<120> 一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒、重组菌及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccgggacaa agagtaaaga agaacaatgg catcttctat gctgtcttct gcgactatgg 60
ttgcgtctcc ggctcaggct actatggtgg caccgttcaa cggtctgaag tcctccgcgg 120
ctttcccggc tactcgtaaa gcgaacaacg acattaccag cattacctct aacggtggtc 180
gtgtgaactg catgaacaac ccgtctctgc tgaaccatgc ggtggaaacc atggcggtgg 240
gttccaaatc cttcgcgacc gcgtctaagc tgttcgatgc aaagacccgt cgttctgtgc 300
tgatgctgta tgcatggtgc cgccattgtg acgacgttat cgacgaccag actctgggct 360
tccaggcacg tcagccggcg ctgcagactc cggaacagcg tctgatgcag ctggagatga 420
agactcgcca ggcttatgca ggctctcaga tgcacgaacc ggcgttcgct gctttccagg 480
aagttgcgat ggcgcatgat atcgctccgg catacgcgtt tgatcatctg gaaggcttcg 540
ctatggacgt gcgcgaggcg cagtactccc agctggacga taccctgcgc tactgctacc 600
acgttgctgg tgttgtgggc ctgatgatgg cacagatcat gggtgttcgt gataacgcga 660
ccctggatcg cgcatgtgac ctgggtctgg cattccagct gactaacatt gcgcgtgaca 720
ttgttgacga tgcgcacgca ggccgttgtt atctgccggc gtcttggctg gaacacgaag 780
gcctgaacaa agaaaactac gctgcaccgg aaaaccgtca ggcactgtct cgcatcgctc 840
gccgcctggt gcaggaagca gagccgtact atctgagcgc gactgcgggc ctggctggcc 900
tgccgctgcg tagcgcttgg gcgattgcta ccgctaagca ggtgtaccgc aaaatcggtg 960
tgaaggttga gcaggcaggt cagcaggcgt gggatcagcg tcagtccacc actaccccgg 1020
aaaaactgac cctgctgctg gcagctagcg gccaggcgct gacttctcgt atgcgtgcac 1080
atccgccgcg tccggcacac ctgtggcagc gtccgctgtc tagacagctg ctgaactttg 1140
atctgctgaa actggctggt gacgtggagt ctaaccctgg tccgatggcg tcctctatgc 1200
tgtcttctgc tactatggtg gcatctccgg ctcaggcaac tatggtggca ccgtttaacg 1260
gtctgaagtc ttccgcagct ttcccggcaa ctcgcaaggc aaacaacgat attactagca 1320
ttacttccaa cggtggccgt gttaactgca tgctgagcaa gctgcagtct attagcgtta 1380
aggctcgccg tgtggagctg gctcgtgaca ttacccgtcc gaaagtttgt ctgcacgcgc 1440
agcgttgtag cctggtgcgt ctgcgtgtgg cggctccgca gactgaagag gcactgggta 1500
ccgttcaggc tgcaggtgcg ggcgacgaac actccgctga tgtggctctg cagcagctgg 1560
atcgtgcgat tgcagaacgt cgtgcgcgtc gcaaacgcga acagctgagc tatcaggcag 1620
cggctatcgc tgcttctatt ggtgtgtccg gtattgcgat cttcgcgacc tatctgcgtt 1680
tcgctatgca catgactgtg ggtggtgcgg ttccgtgggg cgaagttgcg ggtactctgc 1740
tgctggttgt tggtggcgct ctgggcatgg agatgtatgc gcgttatgcg cacaaagcga 1800
tctggcacga gtccccgctg ggttggctgc tgcacaaaag ccatcacacc ccgcgtaccg 1860
gtccgttcga ggctaacgat ctgtttgcaa tcatcaacgg cctgccggcg atgctgctgt 1920
gcaccttcgg cttctggctg ccgaacgtgc tgggcgcggc ttgtttcggc gcaggtctgg 1980
gtatcactct gtacggcatg gcgtacatgt tcgtgcatga tggtctggtt catcgtcgtt 2040
tcccgactgg cccgatcgcg ggtctgccgt atatgaaacg cctgactgtt gctcatcagc 2100
tgcatcattc tggcaaatat ggcggtgcgc cgtggggtat gttcctgggt ccgcaggaac 2160
tgcagcatat tccgggtgcg gctgaggaag tggaacgtct ggtgctggaa ctggactggt 2220
ccaaacgtca gctgctgaac ttcgatctgc tgaaactggc gggtgacgtg gaatctaacc 2280
ctggtccgat ggctagctct atgctgtcct ccgctaccat ggttgcgtcc ccggcacagg 2340
cgactatggt ggctccgttc aacggcctga aatctagcgc tgcatttccg gcgactcgta 2400
aggcgaacaa cgacatcact tctatcacca gcaacggcgg tcgcgttaac tgtatgggtc 2460
cgggtatcca gccgaccagc gcgcgtccgt gttctcgtac taaacactct cgttttgcac 2520
tgctggcggc agcactgacc gctcgtcgtg tgaaacagtt caccaagcag tttcgttctc 2580
gccgcatggc agaggacatt ctgaagctgt ggcagcgtca gtatcatctg ccgcgtgaag 2640
attctgacaa gcgtaccctg cgtgagcgcg ttcatctgta tcgtccgccg cgtagcgacc 2700
tgggcggcat cgcggttgcg gttaccgtta ttgctctgtg ggcaaccctg tttgtttatg 2760
gcctgtggtt cgttaagctg ccgtgggcgc tgaaagttgg tgagaccgct acttcttggg 2820
cgaccatcgc agcggttttc ttctctctgg aattcctgta cactggtctg ttcatcacca 2880
ctcacgatgc gatgcacggt actatcgcac tgcgtaaccg tcgtctgaac gattttctgg 2940
gtcagctggc aatttccctg tacgcgtggt ttgactattc tgtgctgcac cgtaaacatt 3000
gggaacatca taaccatacc ggcgaaccgc gtgttgaccc ggacttccat cgtggcaacc 3060
cgaacctggc agtgtggttc gcgcagttta tggtgagcta catgactctg tcccagtttc 3120
tgaagatcgc ggtttggtcc aacctgctgc tgctggcggg tgcgccgctg gcaaaccagc 3180
tgctgtttat gaccgcagca ccgatcctgt ctgcgttccg cctgttctat tacggcactt 3240
atgttccgca ccatccggag aagggccata ctggcgcgat gccgtggcag gtttcccgca 3300
cttcttccgc atcccgcctg cagtcctttc tgacttgcta tcatttcgac ctgcactggg 3360
agcatcatcg ttggccgtat gctccgtggt gggagctgcc gaaatgccgt cagatcgcac 3420
gtggcgcagc tctggctcag ctgctgaact tcgatctgct gaagctggca ggcgacgttg 3480
aatccaaccc tgggcccatg gcttcttctg catttgcttt tccttcttac ataataacca 3540
aaggaggact ttcaactgat tcttgtaaat caacttcttt gtcttcttct agatctttgg 3600
ttacagatct tccatcacca tgtctgaaac ccaacaacaa ttcccattca aacagaagag 3660
caaaagtgtg tgcttcactt gcagagaagg gtgaatatta ttcaaacaga ccaccaactc 3720
cattacttga cactattaac tacccaatcc acatgaaaaa tctttctgtc aaggaactga 3780
aacaactttc tgatgagctg agatcagacg tgatctttaa tgtgtcgaaa accggtggac 3840
atttggggtc aagtcttggt gttgtggagc ttactgtggc tcttcattac attttcaata 3900
ctccacaaga caagattctt tgggatgttg gtcatcagtc ttatcctcat aagattctta 3960
ctgggagaag aggaaagatg cctacaatga ggcaaaccaa tggtctctct ggtttcacca 4020
aacgaggaga gagtgaacat gattgctttg gtactggaca cagctcaacc acaatatctg 4080
ctggtttagg aatggcggta ggaagggatt tgaaggggaa gaacaacaat gtggttgctg 4140
tgattggtga tggtgcgatg acggcaggac aggcttatga agccatgaac aacgccggat 4200
atctagactc tgatatgatt gtgattctta atgacaacaa gcaagtctca ttacctacag 4260
ctactttgga tggaccaagt ccacctgttg gtgcattgag cagtgctctt agtcggttac 4320
agtctaaccc ggctctcaga gagttgagag aagtcgcaaa gggtatgaca aagcaaatag 4380
gcggaccaat gcatcagttg gcggctaagg tagatgtgta tgctcgagga atgataagcg 4440
gtactggatc gtcactgttt gaagaactcg gtctttacta tattggtcca gttgatgggc 4500
acaacataga tgatttggta gccattctta aagaagttaa gagtaccaga accacaggac 4560
ctgtacttat tcatgtggtg acggagaaag gtcgtggtta tccttacgcg gagagagctg 4620
atgacaaata ccatggtgtt gtgaaatttg atccagcaac gggtagacag ttcaaaacta 4680
ctaatgagac tcaatcttac acaacttact ttgcggaggc attagtcgca gaagcagagg 4740
tagacaaaga tgtggttgcg attcatgcag ccatgggagg tggaaccggg ttaaatctct 4800
ttcaacgtcg cttcccaaca agatgtttcg atgtaggaat agcggaacaa cacgcagtta 4860
cttttgctgc gggtttagcc tgtgaaggcc ttaaaccctt ctgtgcaatc tattcgtctt 4920
tcatgcagcg tgcttatgac caggttgtcc atgatgttga tttgcaaaaa ttaccggtga 4980
gatttgcaat ggatagagct ggactcgttg gagctgatgg tccgacacat tgtggagctt 5040
tcgatgtgac atttatggct tgtcttccta acatgatagt gatggctcca tcagatgaag 5100
cagatctctt taacatggtt gcaactgctg ttgcgattga tgatcgtcct tcttgtttcc 5160
gttaccctag aggtaacggt attggagttg cattacctcc cggaaacaaa ggtgttccaa 5220
ttgagattgg gaaaggtaga attttaaagg aaggagagag agttgcgttg ttgggttatg 5280
gctcagcagt tcagagctgt ttaggagcgg ctgtaatgct cgaagaacgc ggattaaacg 5340
taactgtagc ggatgcacgg ttttgcaagc cattggaccg tgctctcatt cgcagcttag 5400
ctaagtcgca cgaggttctg atcacggttg aagaaggttc cattggaggt tttggctcgc 5460
acgttgttca gtttcttgct ctcgatggtc ttcttgatgg caaactcaag tggagaccaa 5520
tggtactgcc tgatcgatac attgatcacg gtgcaccagc tgatcaacta gctgaagctg 5580
gactcatgcc atctcacatc gcagcaaccg cacttaactt aatcggtgca ccaagggaag 5640
ctctgttttg agagctc 5657
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaacctggca gtgtggttc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaggactgc aggcgggatg 20

Claims (6)

1.一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒或者包括所述重组质粒的重组菌在提高亚麻荠种子中类胡萝卜素的含量中的应用；
所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述类胡萝卜素为虾青素。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述类胡萝卜素还选自新黄质、酮式叶黄素、叶黄素、酯化叶黄素、叶绿素、隐黄质、海胆酮、番茄红素、α-胡萝卜素和β胡萝卜素中的一种或几种。
4.一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒或者包括所述重组质粒的重组菌在提高亚麻荠种子总抗氧化能力中的应用；
所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ。
5.根据权利要求1~4任意一项所述应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
将所述重组质粒或者重组菌导入亚麻荠植株，培育，得到亚麻荠种子，从亚麻荠种子中选择颜色为红色的种子，得到目标亚麻荠种子。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述导入的方法包括农杆菌花序浸染法。
CN202010031979.4A 2020-01-13 2020-01-13 一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因nptⅱ的重组质粒、重组菌及应用 Active CN111118059B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010031979.4A CN111118059B (zh) 2020-01-13 2020-01-13 一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因nptⅱ的重组质粒、重组菌及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010031979.4A CN111118059B (zh) 2020-01-13 2020-01-13 一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因nptⅱ的重组质粒、重组菌及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111118059A CN111118059A (zh) 2020-05-08
CN111118059B true CN111118059B (zh) 2021-04-27

Family

ID=70488154

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010031979.4A Active CN111118059B (zh) 2020-01-13 2020-01-13 一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因nptⅱ的重组质粒、重组菌及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111118059B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116640879A (zh) * 2023-07-20 2023-08-25 捷康生物科技(海南)有限公司 转基因玉米事件p2DBEN-CP-BZ-12及其检测方法
CN116622904A (zh) * 2023-07-20 2023-08-22 捷康生物科技(海南)有限公司 转基因玉米事件p2DBEN-CP-BZ-6及其检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101300358A (zh) * 2005-10-13 2008-11-05 发展生物工程与基因技术的彼得和特劳德尔·恩格尔霍恩基金会 真核细胞中变胞藻黄素的生物合成
CN102888425A (zh) * 2012-07-02 2013-01-23 中国科学院昆明植物研究所 利用转基因植物生产虾青素的方法
CN105907780A (zh) * 2016-04-29 2016-08-31 华南农业大学 一种在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101300358A (zh) * 2005-10-13 2008-11-05 发展生物工程与基因技术的彼得和特劳德尔·恩格尔霍恩基金会 真核细胞中变胞藻黄素的生物合成
CN102888425A (zh) * 2012-07-02 2013-01-23 中国科学院昆明植物研究所 利用转基因植物生产虾青素的方法
CN105907780A (zh) * 2016-04-29 2016-08-31 华南农业大学 一种在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Extraction of astaxanthin from engineered Camelina sativa seed using ethanol-modified supercritical carbon dioxide;Liyang Xie等;《The Journal of Supercritical Fluids》;20180820;第143卷;摘要，第172页第2.1节 *
From Golden Rice to aSTARice: Bioengineering Astaxanthin Biosynthesis in Rice Endosperm;Qinlong Zhu等;《Molecular Plant》;20181203;第11卷(第12期);摘要、第1441页右栏第3段、1442页左栏第1段、第1444页左栏第1段以及第1445页右栏第4段 *
Genetic engineering of the green alga Chlorella zofingiensis: a modified norflurazon-resistant phytoene desaturase gene as a dominant selectable marker;Jin Liu等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20140304;第98卷(第11期);第5069–5079页 *
Qinlong Zhu等.From Golden Rice to aSTARice: Bioengineering Astaxanthin Biosynthesis in Rice Endosperm.《Molecular Plant》.2018,第11卷(第12期), *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111118059A (zh) 2020-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108864267B (zh) 甘薯类胡萝卜素合成和耐盐抗旱相关蛋白IbARF5及其编码基因与应用
CN102791729A (zh) 用于作物改良的成花诱导剂的分子工程
CN111118059B (zh) 一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因nptⅱ的重组质粒、重组菌及应用
CN113957086B (zh) SlBIN2基因在调控番茄果实成熟和类胡萝卜素合成中的应用
CN114014917B (zh) 一种FvbHLH36蛋白及其编码基因和用途
KR101679130B1 (ko) Bass2 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 종자의 크기 및 종자 내 저장 지방의 함량 증가용 조성물
CN111334519B (zh) 一种表达类胡萝卜素的融合基因、重组质粒及应用
CN115851765B (zh) 粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10及其应用
KR20140040372A (ko) Ｒｏｍｔ 및 ｓｔｓ 유전자를 이용한 식물의 스틸벤 함량을 증가시키고 화색을 변화시키는 방법
CN114752607B (zh) 香蕉MtLUT5基因、克隆方法、表达载体及应用
CN111197053B (zh) 一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒、重组菌及应用
CN115948456A (zh) 一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法
CN111154772B (zh) 梨糖转运基因PbSWEET4及其应用
CN103917087B (zh) 大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法以及由此制备的植物体
CN111808181B (zh) 马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的应用
CN111206042B (zh) 一种表达酮式类胡萝卜素的融合基因、重组载体及其应用
KR102080827B1 (ko) 수발아 저항성을 증진시키는 벼 유래의 ＯｓＰＨＳ３ 유전자 및 이의 용도
CN109971765B (zh) 一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77及其应用
KR100990369B1 (ko) 식물 스트레스 저항성을 증가시키는 ＡｔＵＢＰＨ1 및ＡｔＵＢＰＨ2 유전자의 돌연변이체 및 상기 유전자가도입된 성장을 촉진시키는 형질전환 식물체
CN116554291B (zh) 一种梨bZIP类转录因子PubZIP914及其应用
KR102579955B1 (ko) 비타민 c 함량을 증대시키는 배추 유래 광수용체 유전자 및 이의 용도
CN114990133B (zh) 一个烟草类胡萝卜素代谢相关的基因及应用
CN114672499B (zh) 一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS及其启动子和应用
CN117904151A (zh) 一种促进玉米黄素含量积累的LbaBCH2基因及其应用
CN113637686A (zh) 马铃薯StABL1基因在调控马铃薯熟性中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant